西达本胺对人前列腺癌DU145及PC3细胞凋亡的影响

目的:研究西达本胺对前列腺癌DU145、PC3细胞生长抑制及凋亡调控的作用。方法:设置西达本胺浓度分别为4、8、16、32和64μmol/L的5个处理组和对照组(未加西达本胺),分别处理DU145、PC3细胞不同时间,采用MTT法检测细胞的增殖抑制情况,用倒置显微镜观察细胞形态,用流式细胞仪进行细胞凋亡分析,用免疫印迹法检测细胞内Bax、Bcl-2、caspase-3、caspase-9的表达水平。结果:与对照组比较,西达本胺处理组可使细胞明显变圆、体积缩小、脱壁细胞增多;MTT法检测显示,随着西达本胺浓度的增加和作用时间的延长,对DU145、PC3细胞的增殖抑制作用增强,并呈时间、剂量正相关(P<0.01);流式细胞术显示,对照组和16、64μmol/L西达本胺组细胞凋亡率分别为42.24%、50.23%;随着西达本胺浓度的增加,Bcl-2的表达呈下调趋势,Bax、caspase-3、caspase-9的表达呈上调趋势,呈剂量正相关。结论:西达本胺对前列腺癌DU145、PC3细胞生长具有明显的抑制作用,作用机制可能与Bax、Bcl-2、caspase-3及caspase-9凋亡信号通路有关。     

松果体接触脑脊液神经元的实验研究

为证实大鼠接触脑脊液神经元内视紫红质的存在及光照对其的影响,将大鼠处死后立即取出松果体,通过免疫组织化学方法用荧光显微镜检测视紫红质的存在;用电生理方法来证实光照对松果体上的视紫红质可产生作用。在松果体接触脑脊液神经元及松果体内部有视紫红质反应阳性细胞存在;光照松果体后,可使松果体的神经元诱发放电频率明显增加。并且,与光照前松果体自发放电相比有显著差异。哺乳动物松果体接触脑脊液神经元内存在有视蛋白;松果体除了经典的途径调节褪黑素的释放外,可能还有其他途径:光照松果体,可诱导松果体放电或放电频率增加,从而影响褪黑素的释放。     

小鼠主动脉血管平滑肌原代细胞的分离培养及鉴定

目的:血管平滑肌细胞在人类心血管疾病中具有重要的作用,而作为重要的遗传学研究模式生物的小鼠血管平滑肌材料有限,因此建立一种简单高效的小鼠血管平滑肌原代细胞分离培养方法很重要。方法:分离小鼠主动脉中膜层,胶原酶消化法获得原代平滑肌细胞,免疫荧光方法检测细胞的纯度和分化状态;分离平滑肌细胞特异的报告小鼠的平滑肌细胞,LacZ染色鉴定。结果:用该方法分离的原代平滑肌细胞生长迅速,3d后即可达5×106个。免疫荧光显示,细胞传至第3代后纯度在98%以上,细胞传至8代分化状态没有改变。LacZ染色鉴定报告小鼠分离的3代平滑肌细胞98%以上显示特异的蓝染。两种实验证明,应用此方法分离原代平滑肌细胞可以满足平滑肌体外功能实验的需求。结论:与传统的组织块培养法相比,该方法操作简便、经济,可以获得更多高纯度的血管平滑肌细胞。     

肝癌细胞雌激素受体显性阴性突变体ERδ5基因的分离及生物学功能分析

临床流行病学研究显示,ERα基因第5外显子缺失突变体ERδ5在原发性肝细胞癌特异性高表达,它被认为是判断肝癌预后的最重要的新型分子标志.本研究从肝癌细胞分离雌激素受体突变体ERδ5基因,并对其进行克隆、表达,探讨其分子生物学特性及生物学功能. 通过反转录PCR,从肝细胞分离出ERδ5基因并将其克隆到真核表达载体,通过体外翻译及Western 印迹验证该基因成功表达;通过细胞荧光技术检测了ERδ5在肝细胞中的定位;利用荧光素酶报告基因检测技术确证ERδ5对ERα转录活性的影响.结果发现,从肝癌细胞分离出长1 113bp的ERδ5基因,该基因编码蛋白在体外不稳定,易于降解.在肝癌细胞中,ERδ5蛋白主要定位在细胞核,与ERα定位极为相似,但在生物学功能上,ERδ5能够明显干扰ERα的转录活性.研究结果表明,ERδ5作为显性阴性突变体,在肝癌细胞中直接抑制ERα的转录活性.     

利用RNA干扰抑制具有多种剪接形式的RNA结合蛋白基因的表达

目的:构建具有多种剪接形式的RNA结合蛋白(RBPMS)基因siRNA的真核表达载体,观察其对RBPMS表达的影响。方法:利用RNA干扰(RNAi)技术,设计并合成了2条针对RBPMS基因的siRNA,将其克隆到siRNA表达载体pSliencer2.1-U6neo上。将重组质粒和带FLAG标签的RBPMS共转染293T人胚肾细胞,通过Western印迹检验RNAi效应。结果:测序证明成功构建了RBPMSsiRNA真核表达载体;Western印迹表明构建的siRNA能有效地抑制RBPMS基因的表达。结论:构建了RBPMSsiRNA的真核表达载体,该siRNA能有效地抑制RBPMS基因的表达。     

利用胚胎干细胞分化的拟胚体研究小鼠早期胚胎发育过程

小鼠胚胎干细胞(ES细胞)具有分化的全能性已经得到广泛共识。ES细胞在体外分化所形成的拟胚体在结构上能够模仿早期胚胎发育过程,包括在内细胞团表面形成内胚层、柱状上皮细胞的分化,以及中央空腔的形成。本文介绍利用拟胚体研究小鼠早期胚胎发育过程中各个胚胎阶段的发育、细胞程序性死亡的发生及TGF-β信号在胚胎发育过程中的作用。     

人乳头瘤病毒HPV16 E7蛋白基因在沙门氏菌疫苗菌株X4072中的表达

采用ＰＣＲ方法,从ＨＰＶ１６型质粒中分离出ＨＰＶ１６Ｅ７基因片段,用ＥｃｏＲＩ和Ｓａｌｌ双酶解后,定向插入到表达质粒ｐＹＡ３３３２（ａｓｄ＋）的Ｐｔｒｃ启动子下游,构建成ｐＹＡ３３３２－ＨＰＶ１６－Ｅ７重组表达质粒。在大肠杆菌Ｘ６２１２上筛选出重组质粒后,通过中间菌株Ｘ３７３０的转化过渡,将重组质粒导入鼠伤寒沙门氏减毒疫苗菌株Ｘ４０７２（ａｓｄ－）,构建成宿主和载体之间具有平衡致死结构的ＨＰＶ１６     

OPTA对乳酸脱氢酶的抑制动力学

邹承鲁建立的酶活性不可逆改变动力学理论已为实验所验证,它不仅适用于单底物酶的抑制和激活的动力学研究,而且也适用于双底物酶反应系统.但在双底物酶反应系统中,底物和酶的结合方式有四种机制,即随机机制、有序机制、强制有序机制和乒乓机制,迄今为止这一动力学方法仅对随机机制的肌酸激酶进行了实验研究.而其它机制的实验研究尚未见诸报道.我们选用了有序机制的乳酸脱氢酶(LDH),用邻苯二甲醛(OPTA)为抑制剂对该酶的抑制过程进行了实验研究.结果表明,OPTA对该酶的抑制为不可逆抑制.其产物生成与时间的关系曲线符合邹氏方程:[P]=[P]_x(1-e~(-A[OPTA]).由ln([P]_x-[P])对t作图为一直线,表明它的抑制作用为单相动力学过程,抑制剂与酶的结合为一步反应.由直线的斜率A[OPTA]对[OPTA]作图为一过原点的直线.说明表观速度常数A与OPTA的浓度无关.OPTA与酶的结合为非络合型.测得的OPTA与EE-NADH结合的微观速度常数分别为:K(?)=49.6(mmol L)~(-1)min,(?)=2.31(mmol L)min~(-1)(?).明显小于(?)的事实表明.NADH对失活有明显的保护作用.OPTA是一个竞争性的不可逆抑制剂.用传统的方法测得的(?)为42.5(mmol L)min~(-1).与邹氏方法测得的结果非常接近.     

2．5分辨率单斜Al－（L－丙氨酸）胰岛素晶体结构研究

空间群为Ｐ２１的Ａ１－（Ｌ－丙氨酸）胰岛素晶胞内,一个不对称单位含有一个六聚体,应用差值Ｆｏｕｒｉｅｒ技术,立体化学制最小二来技术和Ｘ—ＰＬＯＲ程序并辅以电子密度图的人工拟合,解析了分辨率ＡＩ—（Ｌ－丙氨酸）胰岛素（Ａｌ－Ｌ－ＡｌａⅠ）的晶体结构。最终Ｒ因子为２０．６％,与标准键长与键角的均方根偏差分别为和４．１９°,从电子密度图与模型的拟合来看,六聚体中每条Ａ链的Ａｌ位置替换的Ｌ—Ａｌａ清晰可见,每条Ｂ链Ｎ端Ｂ１—Ｂ８伏段都为α螺旋构象,形成了Ｂ１—Ｂ１９的连续α螺旋段。     

铜陵淡水豚国家级自然保护区半自然水域鱼类群落结构研究

2021年5月采用多网目复合刺网和抛网相结合的方法,对铜陵淡水豚国家级自然保护区半自然水域夹江鱼类群落进行了调查。共采集到鱼类30种,隶属于5目7科27属。相对重要性指数显示鲢（Hypophthalmichthys molitrix）、贝氏?（Hemiculter bleekeri）、似鳊（Pseudobrama simoni）、团头鲂（Megalobrama amblycephala）、鳊（Parabramis pekinensis）和翘嘴鲌（Culter alburnus）为群落优势种。与长江江豚（Neophocaena asiaeorientalis）争夺饵料资源的凶猛性鱼类比例达到2.4%,体长分布显示夹江中存在大量长江江豚无法摄食的大个体鱼类（17.5%）。夹江鱼类群落的Shannon-Weiner指数、Simpson指数、Margalef指数和Pielou均匀度指数依次分别为1.955~2.181,0.794~0.820,2.952~3.856和0.705~0.730。空间生态位宽度指数、平均拥挤度和生态位重叠指数表明,夹江优势种鱼类可能存在较为激烈的种间竞争。建议清理鳡（Elopichthys bambusa）、翘嘴鲌、达氏鲌（Culter dabryi）和乌鳢（Channa argus）等凶猛性鱼类及其他与长江江豚争夺饵料的鱼类,及时捕捞全长超过25 cm的鱼类,补充投放鲢、似鳊、银鲴（Xenocypris argentea）等长江江豚偏好摄食鱼类。