马立克氏病病毒pp38／pp24聚合体结构及其对pp38基因上游双向启动子活性的影响

前期以氯霉素乙酰转移酶（CAT）活性为指标的研究证明了,马立克氏病病毒（Marek’s disease virus,MDV）的pp38和pp24的同时表达可显著增强基因组中pp38基因与1．8kb mRNA转录子之间双向启动子的转录活性．本研究又以增强型绿色荧光蛋白（EGFP）表达水平作为pp38基因上游双向启动转录活性的标志,更直观地证明了只有当同一细胞内同时表达pp38和pp24时,该启动子活性才有完整的启动活性．为了证明这两个蛋白能否相结合,分别以单独表达pp38或pp24的重组质粒pcDNA-pp38或pcDNA-pp24及能同时表达这两个基因的重组质粒pBud-pp38-pp24质粒转染鸡胚成纤维细胞（CEF）,用pp38特异的单克隆抗体H19对转染细胞的裂解标记物进行免疫沉淀实验．结果表明,H19可沉淀pp38,但pp24只是在pp38同时存在时才被H19沉淀,而在pcDNA-pp24单独转染的处理样品中不能显示pp24的条带．这证明了,pp24是通过与pp38的结合而被共沉淀下来的,显示pp24和pp38在天然状态下可以形成异二聚体或多聚体．上述两个独立的实验结果表明,pp38和pp24是以聚合体的形式结合于该双向启动子发挥作用的．     

北京地区呼吸道合胞病毒分离株G蛋白基因遗传变异特性研究

为了解北京地区人呼吸道合胞病毒（human respiratory syncytial virus,HRSV）的遗传变异和分子流行病学特征,首次对北京地区2003～2004年63株HRSV分离株进行了G基因3’末端的第2个高度变异区的序列测定,并进行了基因分型和遗传变异的分析。使用不同的型特异性引物对GPA—F1和GPB-F1分别扩增A、B血清型HRSVG基因3’末端核苷酸序列,特异性扩增产物和随后的序列测定结果均显示,北京地区2003～2004年63株HRSV毒株中,96．8％（61／63）为A血清型,3．2％（2／63）为B血清型,说明北京地区在2003～2004年间存在HRSVA、B血清型共循环,但以A血清型病毒为主。分别对北京流行的A和B血清型病毒进行了基因亲缘性关系分析,结果提示,61株北京A血清型分离株全部为GA2基因型;2株B血清型分离株为GB3基因型。由此看来,GA2基因型是北京地区2003～2004年的优势流行基因型。北京61株GA2分离株之问核苷酸和氨基酸同源性分别在87．8％～100％和77．9％～100％之间;2株B血清型分离株之间核苷酸和氨基酸同源性分别为94．7％和88．1％。这说明在2003年和2004年有很多个不同的GA2基因型HRSV毒株在北京地区共循环,北京地区的HRSV流行存在着许多由不同病毒株引起的传播链。B血清型分离株Beijing04-11于G基因3’末端含有一个60个碱基的重复序列,这是HRSV多聚酶易于重复复制限定序列的一个极端的例子,有可能是HRSV逃逸免疫压力而不断进化的一种方式。该研究首次对北京地区2003年和2004年流行的HRSV进行了基因分型和遗传变异的研究,对于了解北京HRSV流行株的基因特征具有重要意义,可以为北京乃至中国疫苗株的选择提供参考依据,从而指导HRSV的免疫预防控制。     

Ad5-knob蛋白在大肠杆菌中可溶性表达及其活性检测

采用PCR技术, 从AdEasy 1质粒DNA中获得knob全长序列, 克隆入pGEM T vector中。DNA测序鉴定后, 构建pQE 30/knob重组表达载体, 转化大肠杆菌M15 pREP4),IPTG诱导表达腺病毒5 型纤维蛋白的knob功能域(Ad5 knob), SDS PAGE分析,表达产物主要以可溶性蛋白的形式存在于细菌裂解液上清之中。经Ni2 NTA亲和层析一步分离纯化后,洗脱产物中Ad5 knob蛋白纯度超过95%。N 端氨基酸测序证实了纯化产物为Ad5 knob蛋白,细胞受体结合实验检测到所得蛋白能够与Hela细胞上的相应受体特异性结合。上述结果表明在大肠杆菌中已经高效表达了可溶性Ad5 knob蛋白,一步即纯化该蛋白,并具有良好的生物活性,为其下阶段的深入研究提供了重要的实验材料。     

猪体细胞核移植的研究进展和影响因素

自2000年Polejaeva IA获得第1头克隆猪后,短短几年时间全世界已有10多例成功的报道,使得猪的体细胞核移植有了长足的发展,但目前猪的体细胞核移植效率依然低下（1—2％）,人们对核移植中重编程分子机理的认识知之甚少。简要综述了猪体细胞核移植近年来的研究进展,就猪核移植中的技术难点和影响因素进行了分析,涉及供体细胞种类的选择、体外长期培养和高压筛选对随后核移植的影响以及供核细胞细胞周期的选择,核质双方的协调,去核和注核方法的选择,融合和激活程序的优化,妊娠的维持等。     

以单细胞免疫荧光技术观察烟草细胞融合过程中微管骨架的变化

本文建立了单细胞免疫荧光标记技术并以此结合单对细胞融合技术对细胞融合过程中微管骨架组织形式的动态变化进行了追踪观察。发现在聚乙二醇(PEG)诱导条件下,一旦细胞开始粘连,细胞内微管骨架便开始解聚。在细胞融合的整个过程中一直维持着这种解聚的状态,直到融合完成,在后续的培养中微管骨架才重新出现。在微管骨架呈解聚状态时融合产物不能完成与另外的细胞融合。实验揭示了细胞的再融合能力可能受细胞本身微管骨架状态的影响。该结果为解释高等植物如何避免多精入卵提供了新的可能性。     

增强UV-B辐射对麻花艽叶片的抗氧化酶的影响

以青藏高原的特有植物麻花艽为材料,研究麻花艽叶片抗氧化酶系统对增强UV-B辐射的响应。结果表明：在UV-B处理初期,麻花艽叶片SOD、POD的酶活性都能增加,但随着处理时间的延长,SOD、POD的活性呈现下降趋势。麻花艽叶片CAT的酶活性在UVB处理后下降明显,但作为清除叶绿体中H2O2的关键酶AP的酶活性表现为明显地增加趋势,说明在对麻花艽叶片增强UV-B辐射反应中AP起有着重要作用。MDA的含量随UV-B处理时间延长而增加,表明UV-B降低了细胞内活性氧自由基的清除能力,膜脂过氧化作用加剧,导致了对麻花艽叶片的伤害效应。     

植物数量性状变异的分子基础与QTL克隆研究进展

探讨数量性状变异规律以便对其进行遗传操纵一直是植物遗传学的一个重要领域。DNA分子标记和QTL作图技术的发展以及拟南芥和水稻全基因组测序的完成极大地促进了植物数量性状分子基础的研究。现已克隆了拟南芥ED1、水稻Hdl、玉米Tb1、番茄fw2．2和Brii9-2-5等控制目标数量性状的基因。数量性状表型变异不仅源于多个数量性状基因（QTL）的分离．而且还受到内外环境的修饰。QTL等位基因变异与孟德尔基因变异具有类似的分子基础,即基因表达或蛋白质功能发生改变。通过分析已克隆的植物QTL的变异特征及分子基础,讨论了植物QTL克隆技术策略,并对QTL研究所面临的挑战和应用前景进行了展望。     

不同强度的UV-B辐射对高山植物麻花艽光合作用及暗呼吸的影响

以人工种植的多年生高山植物麻花艽(Uentiana straminea)为材料,在3个不同强度的UV—B辐射处理下,定时测定处理和对照叶片的净光合速率、表观量子效率和暗呼吸的变化。结果显示：UV—B处理对麻花艽叶片的光合作用在短期内有一定的抑制作用,但随着处理时间的增加,该高山植物能很快地适应强UV—B辐射的处理。表明麻花艽这种青藏高原常见的高山植物在长期的自然选择过程中可能已经形成了适应UV—B辐射的特有生理机制。暗呼吸的实验结果亦表明：在3种强度的UV—B辐射处理下,麻花艽叶片的呼吸作用从一开始就未受到抑制;随着UV—B辐射时间的增加,UV—B辐射强度越高,呼吸强度越强;这可能是UV—B辐射并未引起麻花艽呼吸机构的破坏所致。     

超强毒IBDV细胞克隆化毒回归鸡后的致病性与VP2基因高变区的分子变化

为了研究超强毒鸡传染性法氏囊病病毒(vvIBDV)的致病性及其VP2基因高变区的分子变化,以vvIBDV GX8/99株囊毒为研究对象,将该毒在SPF鸡胚连传10代后,再在鸡胚成纤维细胞(CEF)上连续盲传.该病毒在CEF上传至22代时开始引发CEF细胞病变,随之在96孔细胞培养板上用无限稀释法连续克隆2次后获得了4个病毒克隆,再将该4个病毒克隆分别连续回传3～5周龄SPF鸡10代.分别比较4个克隆毒及其回传SPF鸡后不同传代毒,对4～6周龄SPF鸡的致病性及VP2高变区氨基酸分子的变化,结果表明,4个克隆化毒的细胞培养毒对SPF鸡只有0～6.7%的致死率,不同克隆毒的SPF鸡传代毒对SPF鸡的致病性却都逐渐增强,但程度差异很大,其中克隆#5在回鸡1、5和10代后的致死率从0分别增加到10%、20%和27%;克隆#4从6.7%增加至13%、17%和23%;但克隆#1和#3的致病性变化相对较小.相对于原始囊毒及鸡胚毒,4个克隆化毒在测序的VP2高变区的约145个氨基酸中,有10个位点发生了相同的变异,变得与适应细胞的疫苗毒D78株基本一致,在回鸡传代导致对鸡毒力增强的过程中,这10个位点中大多数氨基酸不再变化,只有第253位和256位氨基酸从囊毒的Q和I变为细胞适应毒的H和V后,有些病毒克隆回鸡至第10代时又变为原囊毒的Q和I,这表明VP2高变区大多数氨基酸的变异可能与病毒的致病性关系不密切,而与对细胞培养或组织的亲和性的关系更为密切.本研究最重要的意义在于建立的超强毒GX8/99株细胞克隆化毒及其相应的回鸡传代毒系列,为研究vvIBDV其它基因变异与致病性及其它生物学特性的关系,提供了一个新的思路和必要的研究材料.     

Ⅰ型马立克氏病病毒不同致病型参考株与中国分离株pp24基因的克隆与序列分析

为了比较Ⅰ型马立克氏病病毒(MDV)的致病型与pp24基因的关系,将Ⅰ型MDV弱毒(mMDV)、强毒(vMDV)、超强毒(vvMDV)、特超强毒(vv MDV)等不同致病型的CVI988、GA、648A、RB1B、Md5和Md11等6个国际参考株,从中国河北、北京、广东和广西等地分离的7个中国分离株和1个中国疫苗毒814株的pp24基因分别做PCR扩增,并将其克隆到pMD-18载体中测序,与国外已发表的BC-1株进行序列比较.结果表明:Ⅰ型MDV的pp24基因非常保守,15个毒株中只出现5个碱基的随机变化,并引起相应的4个氨基酸改变,但与致病型无明显相关;pp24基因ORF的第81碱基出现差异,所有中国株为G,所有不同致病型国外参考株为C,但并未引起氨基酸改变,显示这一碱基差异只是作为MDV地域性分布的遗传标志,而与病毒分离的年代及致病型等因素无关.