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目的:进行紫杉醇药物生物合成前五步催化酶二磷酸盐合酶(GGPPS)、紫杉二烯合酶(TS)、紫杉二烯5α羟化酶(THY5α)、紫杉二烯5α-O-乙酰转移酶(TAT)和紫杉烷10β羟化酶(TDH)基因在大肠杆菌异源生物合成途径的组建及串联,实现单个表达及串联表达,并试图通过连续生物催化获得紫杉醇中间体紫衫二烯。方法:依据合成生物学中Brick基因组装方法,通过对载体pET30a的酶切位点进行定向改造,设计独特的BglⅡ/BamHⅠ和XbaⅠ/SpeⅠ串联表达盒,在大肠杆菌BM Rosetta(DE3)中表达产物。结果:设计多基因表达盒,实现紫杉醇药物生物合成前五步催化酶的单个表达,GGPPS和TS以及THY5α、TAT和TDH的串联表达。结论:利用BglBrick/BioBrick基因组装方法,可以实现紫杉醇生物合成催化酶的快速组装及后续表达。 相似文献
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目的:构建肿瘤内皮标志物8(TEM8)基因真核表达载体,实现TEM8在HEK293F细胞中的外源表达。方法:用PCR技术扩增TEM8基因,经限制性酶切、连接、转化,插入pcDNA3.1(+)-EGFP真核表达载体,并通过脂质体将TEM8表达质粒转染至HEK293F细胞中,Western印迹检测TEM8的表达。结果:PCR扩增得到TEM8基因,构建了真核表达载体pcDNA3.1(+)-TEM8-EGFP并转染HEK293F细胞,经G418加压筛选及有限稀释法得到生长性状良好、表达效率高的单克隆细胞系TEM8-EGFP/HEK293F;Western印迹证明过表达细胞系TEM8-EGFP/HEK293F显著表达TEM8蛋白。结论:构建了表达TEM8的重组HEK293F工程细胞系TEM8-EGFP/HEK293F,为进一步研究TEM8的生理功能奠定了基础。 相似文献
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Notch信号通路与多种肿瘤的发生发展密切相关。对该通路中各受体功能的深入研究能够为揭示其致癌作用奠定基础。本研究采用RT-PCR的方法从人宫颈癌细胞系HeLa细胞的cDNA中克隆人Notch2和Notch3受体胞内区基因(N2ICD和N3ICD基因),并构建携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的真核表达载体N2ICD/pEGFP和N3ICD/pEGFP,将序列正确的重组质粒转染HeLa细胞,显微镜下可见明显的绿色荧光,并定位在细胞核内。Western blotting检测目的蛋白成功融合表达,并能够提高其下游靶基因Hes1的转录活性。 相似文献
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目的:通过合成生物学的BglBrick方法快速构建不同种类HSA/ Exendin-4长效融合蛋白,为进行各HSA/Exendin-4融合蛋白生物学活性的筛选比较奠定基础。方法:选用酵母表达载体pPICZαA质粒,构建pPICZαA-E4和pPICZαA-HSA两种基础Brick表达载体,运用BglBrick方法,实现了不同数目Exendin-4分子在HSA的不同末端的快速组装。将构建出的10种HSA/Exendin-4融合蛋白,转入毕赤酵母菌KM71H中,用甲醇诱导目的蛋白的表达。结果:用BglBrick方法构建的HSA/Exendin-4融合蛋白在毕赤酵母中都成功诱导表达出相应的目的蛋白。结论:利用BglBrick方法能够实现HSA长效融合蛋白的快速组装。 相似文献
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美国、欧盟和中国生物技术药物的比较 总被引:13,自引:1,他引:12
按照相同表达系统表达的相同氨基酸序列的产品视为同种产品,而不同表达系统表达的相同氨基酸序列的产品视为不同产品的原则,归纳总结了美国、欧盟和中国已批准上市的生物技术药物。美国FDA批准的以基因工程产品、抗体工程产品和细胞工程产品为主要代表的生物技术药物共79种(18种为大肠杆菌表达,8种为酵母表达,53种为哺乳动物细胞培养生产),其中基因重组蛋白质药物为64种。欧盟批准了49种基因重组酶、激素或细胞因子,11种基因重组治疗性抗体和5种基因重组疫苗。在欧美60%-70%的产品由哺乳动物细胞表达。中国批准了27种生物技术药物。比较了美国、欧盟和中国生物制药的特点。 相似文献
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通过RNA干涉沉默SARS病毒的研究前景 总被引:4,自引:0,他引:4
RNA干涉(RNAi)是双链RNA介导的转录后基因沉默作用的重要机制之一。RNAi在后基因组时代的基因功能研究和药物开发中具有广阔应用前景。本综述了RNAi在抗SARS病毒药物研究中的应用前景。 相似文献
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从NFS 6 0细胞中克隆了小鼠粒细胞集落刺激因子 (granulocytecolony stimulatingfactor,G CSF)受体的细胞因子受体同源区 (cytokinereceptorhomologous ,CRH)结构域 ,采用GST融合表达策略 ,实现了CRH结构域的表达 .以纯化的GST CRH融合蛋白为靶 ,从噬菌体随机环七肽库中筛选CRH结构域的结合肽 ,找到两组具有核心序列的噬菌体展示肽 .其中C2和C13噬菌体展示肽能刺激NFS 6 0细胞增殖 ,说明C2和C13噬菌体展示肽具有G CSF活性 相似文献
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以原核表达的具有明胶水解活性的人基质金属蛋白酶 2的催化区 (MCD)为靶标 ,筛选噬菌体随机环七肽库和十二肽库 .找到 6种与MCD特异结合的小肽 ,将 6种小肽基因分别与GST表达质粒重组 ,进行GST融合表达 ,制备融合蛋白 .采用Glutathione Sepharose 4B亲和层析法纯化融合蛋白 ,通过酶抑制实验、体外侵袭实验检测融合蛋白的活性 .结果表明 ,GST C71能够抑制MCD水解 β酪蛋白的活性 ,并且对人纤维肉瘤细胞HT10 80的体外侵袭有明显的抑制作用 相似文献
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通过一种新方法使T7基因Ⅰ置换araBAD基因簇 总被引:1,自引:0,他引:1
目的:用T7RNA聚合酶基因T7基因Ⅰ置换大肠杆菌基因组中的araBAD基因簇。方法:通过分析大肠杆菌基因组中araBAD基因序列,设计两侧同源臂,构建高拷贝数的打靶质粒,并且在这个质粒上的打靶片段两侧各加上一个归巢内切酶位点;将辅助质粒和打靶质粒同时转化到宿主体内,在L-阿拉伯糖的诱导下表达归巢内切酶和Red重组酶,实现体内重组,使T7基因I置换araBAD基因簇。结果:在4株不同的大肠杆菌中用T7基因I置换了araBAD基因簇。结论:成功地将T7基因Ⅰ整合到araBAD基因位置,为构建PAra-PT7表达系统奠定了基础。 相似文献