胰高血糖素样肽1或其类似物体外生物活性检测方法的建立

目的:通过对不同活性检测方法的综合比较,筛选最适的胰高血糖素样肽1(GLP-1)或其类似物的体外活性检测方法,为GLP-1类似物的体外生物活性检测奠定基础。方法:以GLP-1作为阳性药物,用MTT方法检测其对RIN-m-5F、MIN6细胞增殖的影响;用ELISA方法检测其对INS-1、MIN6细胞胰岛素分泌量的影响;用ELISA方法检测其对BHK-GLP-1R细胞cAMP分泌水平的影响。通过对上述方法的综合比较,筛选出最适的活性检测方法。结果:GLP-1对细胞增殖的影响实验结果并不显著,对胰岛素分泌量影响的实验效果明显,对cAMP分泌水平的实验无明显效果。结论:ELISA检测GLP-1或其类似物对MIN6细胞胰岛素分泌量实验可用于GLP-1或其类似物的体外活性检测。     

利用Bio-BglBrick方法表达紫杉醇生物合成酶

目的:进行紫杉醇药物生物合成前五步催化酶二磷酸盐合酶(GGPPS)、紫杉二烯合酶(TS)、紫杉二烯5α羟化酶(THY5α)、紫杉二烯5α-O-乙酰转移酶(TAT)和紫杉烷10β羟化酶(TDH)基因在大肠杆菌异源生物合成途径的组建及串联,实现单个表达及串联表达,并试图通过连续生物催化获得紫杉醇中间体紫衫二烯。方法:依据合成生物学中Brick基因组装方法,通过对载体pET30a的酶切位点进行定向改造,设计独特的BglⅡ/BamHⅠ和XbaⅠ/SpeⅠ串联表达盒,在大肠杆菌BM Rosetta(DE3)中表达产物。结果:设计多基因表达盒,实现紫杉醇药物生物合成前五步催化酶的单个表达,GGPPS和TS以及THY5α、TAT和TDH的串联表达。结论:利用BglBrick/BioBrick基因组装方法,可以实现紫杉醇生物合成催化酶的快速组装及后续表达。