构建重组枯草芽孢杆菌催化制备D-对羟基苯甘氨酸

目的: 在Bacillus subtilis中表达异源D-海因酶基因(hyd)和D-氨甲酰水解酶基因(adc),构建重组细胞作为催化剂,用于生产D-对羟基苯甘氨酸(D-HPG)。方法: 构建hyd表达质粒,考察培养基中二价金属离子对D-海因酶活性的影响。过表达acoR基因,考察AcoR蛋白胞内水平与P_acoA-hyd基因拷贝数的关系。筛选表达adc基因的启动子,构建hyd和adc基因共表达质粒,考察双酶活性菌株的催化特性。结果: 成功构建了海因酶表达质粒pHPS和pUBS,培养基中添加0.8mmol/L的MnCl₂·4H₂O,使168N/pUBS菌株的D-海因酶活性达到956U/gDCW。整合表达P_cdd-acoR基因,使LSL02/pUBS菌株的D-海因酶活性达到1 470U/gDCW。单拷贝P_AE-adc基因的表达水平相对最高。双酶共表达质粒pUBSC被成功构建,菌株LSL02/pUBSC的最适催化温度为40℃45℃,催化活性能够持续12h,当底物起始浓度为20g/L时,反应12h生成的D-HPG达到14.32g/L,转化率达到95%,收率超过80%。结论: 构建具有D-海因酶和D-氨甲酰水解酶双酶活性的重组Bacillus subtilis作为全细胞催化剂,用于海因酶法生产D-HPG,具有技术上的可行性和优势。     

两个不同启动子及其组合对碱性蛋白酶AprE异源表达的影响

背景:碱性蛋白酶(alkaline protease)是一种具有广泛用途的工业酶制剂,其发酵活力目前仍不能满足工业生产需要。目的:旨在通过优化启动子及其组合来提高Bacillus subtilis WB600中碱性蛋白酶AprE的产量。方法:以Bacillus subtilis WB600为出发菌株,成功构建了含有4种不同类型启动子(P1、P2、P-1-2、P-2-1)的碱性蛋白酶AprE表达菌株。结果:含不同启动子的4株重组菌均可成功表达碱性蛋白酶,发酵48h,含单一启动子P2的重组菌株表达碱性蛋白酶的活力为4 041U/ml,是P1的1. 23倍。双启动子重组菌B. subtilis WB600/P-2-1-aprE表达的酶活性最高,是双启动子P-1-2的1. 35倍,达到了6 125U/ml。结论:为工业化高产碱性蛋白酶提供了一种有效策略。     

利用短短芽孢杆菌进行酮还原酶CgKR2的高效表达与纯化

酮还原酶CgKR2能够一步还原前手性羰基化合物生成高附加值的手性醇,有望解决手性醇传统制备方法的步骤烦琐和高成本问题,具有很高的经济效益。研究表明,CgKR2催化底物2-氧代-4-苯基丁酸乙酯(OPBE)生成普利类降压药的重要中间体(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯[(R)-HPBE]具有良好效果。但CgKR2的生产成本高昂、过程烦琐。利用短短芽孢杆菌胞外分泌表达酮还原酶CgKR2,获得该酶的高效表达,并经简便的一步镍亲和层析纯化,即获得高纯度酮还原酶CgKR2,产率高达每升发酵7. 8mg纯酶。以酶标板法测定其比活力、温度稳定性以及动力学参数等基本酶学性质,结果显示,CgKR2的比活力为(78. 32±7. 62) U/mg、Km为(0. 2±0. 02) mmol/L、Vmax为(117. 64±3. 6)μmol/(min·mg)、Kcat为73s-1,与以往报道的数据一致,并且获得的CgKR2纯酶在30℃下孵育72h依然保持80%的活性,酶活的稳定性远好于以往的制备方法。开发出的一套简便高效的酮还原酶CgKR2表达纯化工艺,降低了生产成本、简化了生产工艺,可推进手性醇生物催化制备的普及,对其他生物催化工程酶的制备方法研究也有借鉴作用。     

融合蛋白NusA-hRI的高效异源表达、纯化及活性分析

人核糖核酸酶抑制因子 (human ribonuclease inhibitor, hRI) 是一种能够调节核糖核酸酶活性的酸性包浆蛋白。通过构建含SUMO、IF2、GST、NusA 、MsyB、Trx和 MBP融合标签的重组表达载体,以大肠杆菌BL21(DE3)作为宿主菌进行自诱导(auto-induction,AI)表达,从而使 hRI 的表达量得以提升。利用MagNi磁珠纯化及电泳分析hRI的表达状况,通过RNase/Sepharose亲和层析获得纯度较高的蛋白。纯化后获得的融合蛋白浓度为2 960.513mg/L,与其它公司的hRI活性进行比较,检测其酶活性约为50U/μl,并使其成功用于RNA的保护,为NusA-hRI的应用提供理论依据。     

一种新型亮氨酸5-羟化酶NmLEH的异源表达、纯化及酶学性质分析 *

羟基化氨基酸是一种新型氨基酸衍生物,可广泛用作化工材料的前体物及医药合成的中间体。将来源于Nostoc minutum的新型L-亮氨酸5-羟化酶 (NmLEH) 通过重组质粒在大肠杆菌中异源表达。结果表明,在BL21(DE3) 宿主细胞中,诱导温度为25℃,IPTG诱导浓度为0.5mmol/L,诱导10h时,蛋白质表达量最高 (0.45mg/ml);通过Ni-亲和层析和凝胶过滤层析两步分离纯化获得了高度纯化的重组NmLEH蛋白;对NmLEH的酶学性质进行了表征,该酶的最适反应温度为25℃,最适pH 为7.5,在pH 7.0~9.0较为稳定,最适底物为亮氨酸和甲硫氨酸;同源序列分析表明NmLEH属于亚铁和α-酮戊二酸依赖性双加氧酶家族[Fe(II)/αKG-Dos],并预测了该酶的保守催化活性位点(H150、D152、H236);通过同源建模得到了该蛋白质的模拟结构,分析了该蛋白质催化活性中心的形成机制。     

过表达漆酶基因Lelcc1的香菇菌株构建及表型分析

真菌漆酶（laccase）是一种多酚氧化酶,在真菌生长发育中具有重要作用。本研究采用根癌农杆菌介导转化的方法,以香菇Lentinula edodes菌株W1为受体菌株,在Leactin基因启动子调控下过表达Lelcc1基因;对其中7个单拷贝插入的转化子进行qRT-PCR分析,7个Lelcc1基因表达量较出发菌株W1均上调了1.5-8倍。进一步分析了这7个转化子的遗传稳定性;挑取了3个稳定的转化子进行表型分析,主要包括不同培养基中的生长速度、代料栽培过程中菌棒转色程度、以及透射电镜观察菌丝细胞的超微结构。发现转化子和受体菌株W1的生长速度无显著差异,但代料栽培过程中转化子较W1转色更快,菌棒表面颜色更深;透射电镜观察菌丝细胞的超微结构发现在细胞壁厚度、细胞膜形态等方面,其中两个超量表达转化子与W1间存在显著差异。结果表明,香菇Lelcc1基因可能参与了转色过程中色素合成或积累,也可能与细胞壁形成有关。     

食管癌组织中β-catenin、PTTG及c-myc的表达及其临床意义*

目的:探讨食管癌组织中β-链接素(β-catenin)、垂体肿瘤转化基因(PTTG)、原癌基因(c-myc)的表达及其临床意义。方法:将2015年6月至2017年6月期间新疆医科大学附属肿瘤医院手术切除的食管鳞癌标本98例作为观察组,同时切取癌旁正常黏膜组织标本98例作为对照组,观察两组β-catenin、PTTG、c-myc蛋白表达情况,对比观察组不同病理特征患者β-catenin、PTTG、c-myc蛋白阳性表达情况,并分析食管癌组织中PTTG与β-catenin、c-myc蛋白表达的相关性。结果:观察组β-catenin、PTTG、c-myc蛋白表达阳性率均显著高于对照组,差异有统计学意义(P0.05)。观察组β-catenin、PTTG、c-myc蛋白阳性表达均与患者的TNM分期和淋巴结转移有关(P0.05),与患者的性别、年龄、肿瘤直径以及分化程度无关(P0.05)。食管癌组织中PTTG与β-catenin、c-myc蛋白表达均呈正相关(P0.05)。结论:食管癌患者β-catenin、PTTG、c-myc蛋白表达阳性率较高,与患者的TNM分期和淋巴结转移有关,且PTTG与β-catenin、c-myc蛋白表达呈正相关,三者可作为早期诊断和评估食管癌预后的重要参考指标。     

特定环状RNA表达与衰老的关系研究*

目的:研究小鼠不同组织器官中环状RNA的表达量在年老与年幼中的差异,揭示环状RNA与衰老的联系。方法:通过对不同组织器官的总RNA的提取,分别逆转录,并扩增circUSP34、circTCF4、circTCF20、circZFP64、circPWWP2A、circLIN54,通过凝胶电泳比较其在年轻小鼠与年老小鼠的组织器官中的表达情况,明确上述环状RNA与衰老的联系。结果:环状RNA在不同年龄小鼠的组织器官中存在广泛性的差异性表达,不同组织不同环状RNA有着不同的表达量的改变,其与衰老存在联系。在卵巢中除circTCF4,其余五种环状RNA表达量均与年龄负相关;在肾脏中,除circTCF4与circPWWP2A,其余与年龄呈负相关;在乳腺中只有circUSP3与衰老呈负相关;而在肠道与生长相关的只有上述后三种环状RNA,均呈正相关。其他样本与组织的发育阶段有不同的相关性,具体在结果体现。结论:环状RNA的表达量在组织中与年龄的增大有着显著相关性,环状RNA可能广泛地参与了不同的衰老通路,起到不同的生物学作用,其在衰老的产生中扮演重要角色。     

分泌性中耳炎患者外周血Th1Th2细胞及T淋巴细胞亚群水平的表达及临床意义

目的:探讨分泌性中耳炎(SOM)患者外周血T辅助细胞1(Th1)、T辅助细胞2(Th2)细胞因子及T淋巴细胞亚群水平的表达及其临床意义。方法:选取我院于2015年1月至2018年1月期间收治的SOM患者135例记为SOM组,根据病程将患者分为急性组(病程14d,49例)、亚急性组(病程14-30d,53例)、慢性组(病程30d,33例)。另外选择同期于我院进行体检的100例健康者为对照组。分别对比SOM组和对照组受试者、不同病程SOM患者外周血Th1细胞因子[干扰素(INF-γ)、白细胞介素-2(IL-2)]、Th2细胞因子[白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-10(IL-10)]以及T淋巴细胞亚群[CD3~+、CD4~+、CD8~+、CD4~+/CD8~+]水平。采用Pearson相关性分析INF-γ、IL-2、IL-4、IL-10与CD3~+、CD4~+、CD8~+、CD4~+/CD8~+的相关性。结果:SOM组患者外周血INF-γ、IL-2、IL-4、IL-10水平高于对照组(P0.05);急性组患者外周血INF-γ、IL-2、IL-4、IL-10水平低于亚急性组、慢性组,亚急性组患者外周血INF-γ、IL-2、IL-4、IL-10水平低于慢性组(P0.05)。SOM组患者外周血CD3~+、CD4~+、CD4~+/CD8~+水平低于对照组,CD8~+水平高于对照组(P0.05);急性组患者外周血CD3~+、CD4~+、CD4~+/CD8~+水平高于亚急性组、慢性组,CD8~+水平低于亚急性组、慢性组,亚急性组患者外周血CD3~+、CD4~+、CD4~+/CD8~+水平高于慢性组,CD8~+水平低于慢性组(P0.05)。Pearson相关性分析结果显示,SOM患者外周血INF-γ、IL-4与CD8~+呈正相关(P0.05),IL-4与CD3~+、CD4~+呈负相关(P0.05)。结论:SOM患者外周血Th1Th2细胞因子、T淋巴细胞亚群水平均表现异常,且其水平与疾病发生和发展存在一定联系,通过监测Th1Th2细胞因子、T淋巴细胞亚群有助于评估SOM患者病情。