家蚕bHLH转录因子Bmsage可溶性表达、纯化与结构分析

碱性螺旋-环-螺旋(Basic helix-loop-helix,bHLH)转录因子在生命活动过程中发挥着重要的调控作用。Bmsage是家蚕丝腺中高量表达的一类bHLH转录因子,不仅参与了丝腺细胞在胚胎期的发育调控,而且对蚕丝蛋白的合成也有至关重要的调控作用,然而当前对其性质和结构了解不多。为研究其性质、结构和生物学功能,构建了NusA、MBP、SUMO、Trx和His融合标签的Bmsage重组原核表达载体,通过改变诱导温度和IPTG浓度,确定了Bmsage在大肠杆菌中可溶性表达的最佳载体和表达条件,进而通过镍柱亲和层析纯化获得了Bmsage,利用圆二色光谱研究了其二级结构。结果表明,NusA与MBP标签可显著增强Bmsage在大肠杆菌中的可溶性表达,但难以与Bmsage分离。SUMO标签有一定的助溶效果,并且能够与Bmsage有效分离。其他标签对Bmsage可溶性表达的效果不明显。圆二色光谱分析表明Bmsage含有α-helix结构,推测SUMO标签可能促进了Bmsage折叠形成类天然的结构。这些工作为深入研究Bmsage的性质、结构与功能建立了基础,同时也为其他类似蛋白的表达纯化提供了参考。     

储存温度对单瓣和重瓣紫斑牡丹花粉活力及生理特性的影响北大核心CSCD

以紫斑牡丹‘象牙白’单瓣和重瓣花的花粉为材料,对其超微结构及生理生化特性进行观察和分析,探讨单瓣和重瓣花花粉超微结构以及不同温度储存花粉活力与其可溶性蛋白含量、MDA含量和3种保护酶活性(POD、SOD、CAT)的关系,以确定紫斑牡丹单瓣和重瓣花花粉最佳储存温度。结果表明:(1)紫斑牡丹重瓣花花粉平均极轴长、平均赤道轴长、极轴长/赤道轴长均小于单瓣花花粉;室温(25℃)条件下,单瓣花花粉萌发率(83.62%)高于重瓣花(72.06%),单瓣花和重瓣花花粉的半衰期分别为40 d和60 d;随着储存温度降低和储存时间的延长,单瓣花和重瓣花的花粉萌发率较室温均显著提高,且单瓣花花粉萌发率始终高于重瓣花花粉。(2)紫斑牡丹单瓣和重瓣花花粉在短期储存(1~120 d)、较长时间储存和长期储存的适宜温度分别为4℃、-20℃,-80℃。(3)与室温相比,低温可提高储存期间紫斑牡丹花粉的可溶性蛋白质含量和保护酶活性,并降低MDA含量,从而有效延缓花粉萌发率的下降。(4)低温胁迫对紫斑牡丹单瓣花花粉的影响低于重瓣花花粉,在相同储存温度条件下,重瓣花花粉细胞受损程度更高、萌发率下降速率更快。研究认为,紫斑牡丹花粉在-80℃储存条件下基本处于代谢平衡状态,故低温能有效延长其花粉储存寿命;储存期间花粉萌发率下降的主要原因是细胞膜脂过氧化程度加剧,细胞损伤加重;紫斑牡丹重瓣花花粉粒小、瘪粒和畸形是导致其较单瓣花花粉萌发率低的主要原因。     

家蚕丝腺蛋白质组学研究方法的建立

通过高精度的双向电泳技术对家蚕中部丝腺组织的蛋白质进行分离,采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(matrix-assistedlaserdesorption/ionizationtimeofflightmassspectrometry,MALDI-TOF-MS)对其中一些表达量较高的蛋白点进行鉴定,并利用GPMAW(GeneralProtein/MassAnalysisforWindows)软件结合家蚕基因组预测的蛋白质数据库构建本地的肽质量指纹图谱数据库,对所得到的肽质量指纹图谱进行分析。研究发现,经过双向凝胶电泳及其图象分析技术,硝酸银染色和考马斯亮蓝染色分别能分离出500个以上和100个以上的蛋白点。这些蛋白质点主要集中在分子量15~90kD区域,等电点pH3·5~7之间。MALDI-TOF-MS鉴定的25个考染蛋白点中有60%以上的PMF(PeptideMassFingerprint)的信号峰较强。在数据库检索过程中,利用家蚕肽质量指纹数据库所得检索结果与在Mascot的检索结果相比,前者不仅能够准确鉴定出一些已有研究报道的蛋白,从而验证检索方法的可行性,而且还能够对一些已经被家蚕基因组数据库所预测但未曾报道的新蛋白质进行鉴定,从而建立了一整套适合于家蚕蛋白质组研究的方法,并为其它绢丝昆虫蛋白质组研究提供了重要参考。     

基于超高效液相色谱-质谱技术对野蚕茧和家蚕茧化学成分进行比较

鉴定并比较野蚕茧与家蚕茧的化学成分对于理解家蚕的驯化具有重要的意义。利用高温高压结合甲醇-水提取的方法获得蚕茧中的化学成分,利用UHPLC-MS技术对野蚕、家蚕大造品种和皓月品种3种蚕茧丝中的小分子成分进行鉴定和比较分析。通过阳离子模式和阴离子模式的UHPLC-MS获得了野蚕、大造和皓月蚕茧丝的代谢指纹图谱,对鉴定到的高丰度化合物进行注释,发现其中包括了氨基酸、黄酮、生物碱、萜类、有机酸和木脂素等成分。PLS-DA的得分图表明,野蚕、家蚕大造品种和皓月品种的3种蚕茧的代谢组存在显著差异。发现脯氨酸、亮氨酸/异亮氨酸和苯丙氨酸在大造茧中的含量显著高于在野蚕和皓月茧中的含量,黄酮类植物次生代谢物在大造茧中的含量显著提高,包括槲皮素、异槲皮素、槲皮素-3-O-槐糖苷、槲皮素-3-O-L-鼠李糖苷、槲皮素-3-O-芸香糖苷和山奈酚;而神经碱、白桥楼碱、毛果芸香次碱、美洲豚草内酯、线叶泽兰素和中缅木莲素等生物碱、萜类和木脂素类的植物次生代谢物在野蚕茧中的含量显著高于在家蚕茧中的含量。在紫外光的激发下观察黄酮的绿色荧光发现家蚕大造茧中的黄酮含量最高,家蚕皓月茧中的黄酮含量最低,而野蚕茧中的黄酮含量居中。生物碱和有机酸是良好的抗虫抗菌剂,它们在野蚕茧中的含量较高,能够提高野蚕茧的防护能力。黄酮类物质在家蚕大造茧中的含量较高,是导致家蚕大造茧呈黄绿色的主要原因。     

我国17株绵羊肺炎支原体分子分型及其菌体蛋白免疫印迹

【目的】分别从基因和蛋白水平研究我国部分地区绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae)分离株的分子特征,并了解其免疫原性蛋白的差异。【方法】对分离自8个地区的17株绵羊肺炎支原体进行扩增片段长度多态性(Amplified Fragment Length Polymorphism,AFLP)和十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodium Dodecyl Sulphate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis,SDS-PAGE)分析,采用NTsys-2.10e软件对AFLP和SDS-PAGE结果进行聚类,并用绵羊肺炎支原体模式株Y98高免血清对部分分离株进行免疫印迹分析。【结果】当相似系数分别为0.78和0.85时,绵羊肺炎支原体分离株可根据8个来源地区分成8个AFLP群和8个SDS-PAGE群;用8株分离株进行免疫印迹共出现6条蛋白条带,分子质量分别为105 kDa、83 kDa、65 kDa、42 kDa、40 kDa或26 kDa,其中83 kDa和40 kDa蛋白为8个菌株保守的免疫原性蛋白。【结论】我国部分地区绵羊肺炎支原体分离株之间存在遗传差异,不同分离株的主要免疫原性蛋白也存在一定差异,但83 kDa和40 kDa蛋白为其保守的免疫原性蛋白。本研究首次对我国部分地区绵羊肺炎支原体分离株进行了分子分型与免疫印迹分析,结果将为绵羊肺炎支原体病的新型诊断技术开发和疫苗研制奠定理论基础。     

马铃薯耐盐性的研究进展

土壤盐渍化已是影响全球农业生产和土地资源可持续利用的主要问题之一。近些年马铃薯的种植面积不断扩大,比重逐年上升,而马铃薯却是一种对盐中度敏感的作物,盐渍化对其造成严重的危害,因此研究马铃薯的耐盐性势在必行。本文对国内外马铃薯耐盐性筛选、生长发育、生理生化特性、耐盐途径、转基因耐盐马铃薯的研究及其二倍体马铃薯种质资源的利用和展望进行了综述。     

胰凝乳蛋白酶抑制剂在蓖麻蚕主要组织中的分布及血液中的含量和活性

【目的】蓖麻蚕Samia cynthia ricini 属于鳞翅目昆虫,其体内存在的胰凝乳蛋白酶抑制剂（chymotrypsin inhibitor, CI）对蓖麻蚕的正常生长发育和自身防御能力有重要的作用。获得蓖麻蚕的CI种类分布信息,以及研究各种CI的功能,可以为鳞翅目害虫的生物防治提供理论依据。【方法】本实验通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（native-PAGE）和CI活性染色技术,对18个蓖麻蚕品系的主要组织器官中胰凝乳蛋白酶抑制剂的多态性分布进行了调查,并对各品系血液中的蛋白含量和CI活性进行了测定。【结果】在pH 8.6电泳下,各品系血液中共检测到7条CI活性带,在pH 4.0电泳下,各品系血液中可检测到3条CI活性带;血液中的CI含量从5龄第3天幼虫期到化蛹当天一直维持着很高的含量;头、体壁和脂肪体中的CI都不如血液中的CI含量高,而丝腺中未检测到任何CI。【结论】与家蚕 Bombyx mori 血液中的含量相比,蓖麻蚕血液中的CI含量更高,CI种类多态性分布不仅体现在不同品系的同一组织,还体现在同一品系的不同组织。     

家蚕蛋白酪氨酸磷酸酶基因克隆、表达纯化与结构分析

蛋白酪氨酸磷酸酶(Protein tyrosine phosphatase,PTP,EC 3.1.3.48)特异性地催化去除磷酸化修饰的酪氨酸残基上的磷酸基团,导致蛋白去磷酸化,从而调控了细胞生长、增殖、分化和免疫等生命活动。家蚕Bombyx mori蛋白酪氨酸磷酸酶h(BmPTP-h)参与了核型多角体病毒(Nucleopolyhedrovirus,NPV)在家蚕体内的复制过程,但目前对于BmPTP-h结构和性质的了解并不多。本文从家蚕中肠克隆了BmPTP-h基因编码序列,分析了BmPTP-h的基因组结构、mRNA结构、序列特征、二级结构和溶液中的状态。同源氨基酸序列比对分析表明BmPTP-h与多种昆虫NPV的PTP序列具有高相似度,暗示了它们可能具有共同的起源和相似的功能。文中构建了原核表达载体,通过大肠杆菌在25℃下表达获得了可溶性的重组BmPTP-h,利用Ni-NTA亲和层析纯化了BmPTP-h。凝胶过滤分析显示BmPTP-h在溶液中可以形成聚集体和单体。圆二色光谱分析显示重组的BmPTP-h包含α螺旋结构,升高温度导致BmPTP-h的α螺旋结构去折叠,α螺旋结构含量下降。这些研究为深入研究BmPTP-h的结构和调控机理提供了基础。     

家蚕体液低分子蛋白Apolipophorin Ⅲ的质谱鉴定及表达分析

利用SDS-PAGE电泳对家蚕不同时期的血淋巴蛋白进行了研究。发现在家蚕羽化前,血淋巴液中有一个分子量约20kD的蛋白表达量明显上调。为了探究该蛋白的功能,本研究通过双向电泳分离和肽质量指纹图谱分析对该蛋白进行了鉴定。结果表明,此羽化前后高表达的蛋白为Apolipophorin Ⅲ蛋白,该类蛋白被普遍认为与昆虫的飞行能力有关。利用RT-PCR对该蛋白编码的基因进行了组织表达分析,结果表明该基因除了在马氏管几乎不表达外,其它组织均有表达,这也暗示了该蛋白除了与昆虫的飞行活动有关以外,还参与了幼虫及蛹期的其他重要的生命活动。