荞麦中苯丙氨酸解氨酶活力与黄酮含量的关系（简报）

荞麦幼苗及幼苗不同器官中的黄酮含量随着苯丙氨酸解氨酶(PAL)活力的变化而变化。X射线处理可增强荞麦幼苗中苯丙烷类代谢途径,致使黄酮含量提高。     

荞麦中总黄酮和芦丁含量的变化

苦荞、甜荞叶中总黄酮平均含量达5.3％,芦丁平均含量达4.9％,井在开花结实期达最高峰,后期下降;茎中的含量较低,平均值分别为1.0％和0.7％,生育期中无明显变化。叶、茎中黄酮成分以芦丁为主,占70％～90％。同一时期发育不同的生殖器官总黄酮及芦丁含量的大小顺序为蕾>花>胚乳未充实种子>成熟种子。生殖器官中黄酮成分与芦丁比重因荞麦种别而异。     

荞麦花内蜜腺的解剖学研究

荞麦的花内蜜腺是属于雄蕊之间的花托蜜腺,由八个乳头状腺体组成,但花托内表面部分也为腺质,雄蕊花丝基部的表皮也具分泌细胞的特性。蜜腺组织由分泌表皮和产蜜组织组成,不含有维管束,只在产蜜组织的基部有通向花丝的维管组织经过。这部分维管组织比较特殊,韧皮部分子中,伴胞常大于筛管分子,围绕维管束有一圈中间细胞,富含蛋白质物质。分泌表皮上有正常发育的气孔,其保卫细胞含有丰富的淀粉粒。产蜜组织细胞在发育过程中,液泡出现由无到增多,然后逐渐减少而最后又增加的有规律变化     

苦荞种子胰蛋白酶抑制剂的分离纯化及部分性质研究

采用凝胶层析及离子交换层析等方法,从苦荞种子中分离出一组胰蛋白酶抑制剂（ＴＢＴＩ－Ⅰ、Ⅱ）．对其性质研究表明：两个组分均对胰蛋白酶有较强的抑制作用,对胰凝乳蛋白酶抑制作用较弱,其中ＴＢＴＩ－Ⅱ的抑制作用大于ＴＢＴＩ－Ⅰ,两者对胃蛋白酶、木瓜蛋白酶及枯草杆菌蛋白酶均无抑制作用．用ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳和ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－１００凝胶层析分别对纯化产物进行分析得出ＴＢＴＩ－Ⅰ和ＴＢＴＩ－Ⅱ的近似分子量分别为１５．０ｋＤ和１８．０ｋＤ．ＴＢＴＩ－Ⅰ、Ⅱ都具有较高的热稳定性,在１００℃处理１０ｍｉｎ后可保留８６％左右的抑制活性．ＴＢＴＩ在酸性环境下较为稳定,在ｐＨ２．０条件下保温１ｈ,仍保留７５％的抑制活性．用Ｌｉｎｅｖｅａｅｒ－Ｂｕｒｋ作图法得知,该抑制剂属竞争性抑制类型,ＴＢＴＩ－Ⅱ的Ｋｉ值为３．５９×１０－７ｍｏｌ／Ｌ（以ＢＡＰＮＡ为底物）,对胰蛋白酶的摩尔抑制比为１∶１．４．     

BTI基因转染诱导EC9706细胞凋亡及G_1阻滞

为了研究荞麦胰蛋白酶抑制剂(buckwheat trypsin inhibitor,BTI)对肿瘤细胞凋亡与细胞周期的影响,构建增强型绿色荧光蛋白(EGFP)与BTI融合蛋白真核表达质粒.将BTI基因成功克隆至pEGFP-N1中转染食管癌EC9706细胞后,激光共聚焦显微镜镜检显示,BTI-EGFP获得良好表达.表达的融合蛋白大部分分布于细胞核,在细胞质中有少量分布.Western印迹检测可见约27kD和36 kD的特异性条带.流式细胞术分析结果显示,BTI能够诱导EC9706细胞发生凋亡,并使细胞停滞于G0/G1期.     

基于NIRS法快速检测荞麦蛋白质与淀粉含量的研究

为建立近红外光谱技术测定荞麦蛋白质与淀粉含量的方法,本研究以217份荞麦样品为试验材料,采用最小二乘回归预测和交叉验证构建近红外预测模型。分析表明:前处理采用多元散射校正法(MSC),维数(Rank)分别为5和5,光谱区间6803.9~6094.2/cm所建立的荞麦蛋白质与淀粉含量模型的预测效果较好,其决定系数(R~2)分别为0.9481和0.9167,交叉验证均方根(RMSECV)分别为0.68和2.08,相对分析误差(RPD)分别为4.39和3.46,均大于3.0,外部验证相关系数均大于0.96。本试验所建立的蛋白质与淀粉含量近红外预测模型具有较高的准确度和稳健性,可用于荞麦品质的快速测定。     

rBTI及其突变体对C. elegans寿命的影响

重组荞麦胰蛋白酶抑制剂（recombinant buckwheat trypsin inhibitor,rBTI）是一种来源于荞麦Potato Ⅰ抑制剂家族的丝氨酸蛋白酶抑制剂,具有很好的生物活性及功能。先前的研究表明,rBTI在秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）中具有很好的延长寿命的性质,但其具体的作用机制还不太清楚。本文的研究证明,rBTI能够调节转录因子DAF-16的转录活性,进而影响线虫的寿命,且该性质与其胰蛋白酶抑制活性密切相关。通过定点突变技术,分别对rBTI的45位、53位和44位氨基酸活性位点进行突变,获得了4种不同胰蛋白酶抑制活性的rBTI突变体,分别命名为rBTI-R45A,rBTI-R45F,rBTI-W53R和rBTI-P44T。经典模式生物秀丽隐杆线虫寿命检测实验显示,野生型rBTI可以明显延长C.elegans的寿命,且在0～10 μmol/L 范围内具有浓度依赖性。和未处理对照组相比,10 μmol/L 野生型rBTI延长寿命幅度可达到14.5%,但是突变体rBTI-R45A,rBTI-R45F和rBTI W53R均不同程度失去了延长寿命的功能。利用荧光显微观察及qRT-PCR等方法进一步研究发现,野生型rBTI 可增强寿命调控转录因子DAF-16的转录活性。与寿命检测实验结果一致,4种 rBTI突变体均不能使DAF-16转录活性增强。上述结果表明,在C.elegans中,rBTI可增强长寿因子DAF 16的转录活性,进而延长虫体寿命,且该功能的发挥依赖于其适当的胰蛋白酶抑制活性。本文的结果为进一步研究开发rBTI的功能提供了实验支持和理论基础。     

重组荞麦胰蛋白酶抑制剂通过下调己糖激酶Ⅱ抑制HepG2细胞生长

糖酵解过度活跃是肿瘤细胞能量代谢的显著特征。抑制过度糖酵解已经成为一种新的癌症疗法。重组荞麦胰蛋白酶抑制剂 (recombinant buckwheat trypsin inhibitor, rBTI)可以通过上调磷酸酶及张力蛋白同源基因 (PTEN) 进而抑制HepG2细胞增殖。有关rBTI对肿瘤细胞能量代谢的影响仍未见报道。本研究中的MTT和ATP检测分析表明,rBTI以剂量依赖性方式抑制细胞活力及胞内ATP含量。qRT-PCR和Western印迹分析表明,rBTI处理HepG2细胞后,己糖激酶Ⅱ转录显著下调,但是糖酵解过程中的其他酶及葡萄糖转运蛋白基因在转录水平未发生显著变化,同时己糖激酶Ⅱ蛋白水平的表达也显著下调。酶活性分析也表明,rBTI能显著降低己糖激酶的活性。进一步分析表明, rBTI使细胞内PTEN转录及表达水平明显上调,己糖激酶Ⅱ转录和p-AKT,p-mTOR、己糖激酶Ⅱ的表达下调。当PTEN抑制剂phen存在时,可阻断rBTI诱导的己糖激酶 Ⅱ表达下降,表明rBTI能通过上调PTEN进而影响己糖激酶Ⅱ的表达。免疫荧光及Western印迹分析显示,rBTI作用后减弱了己糖激酶 Ⅱ在线粒体的定位,导致己糖激酶Ⅱ与线粒体电压依赖性阴离子通道蛋白 (voltage-dependent anion channel, VDAC) 分离,促使己糖激酶Ⅱ从线粒体转位到细胞质,降低糖酵解的效率。上述结果证明,rBTI对肿瘤细胞能量代谢的调控作用主要通过抑制PI3K/AKT信号通路,下调己糖激酶Ⅱ的表达并影响空间定位,进而抑制肿瘤细胞糖酵解过程,导致癌细胞生长受到抑制。     

8种甜荞的种子消毒及愈伤组织诱导和增殖条件

8 种甜荞种子表面消毒所适用的消毒剂和处理时间有所不同。10%H₂O₂ 溶液处理150min, 对榆3-3、黎麻道、浦江荞、龙山荞和富源红花荞的种子有很好的消毒作用, 并且处理以后种子仍具有很高的萌发率。8621、B 大粒和美国荞种子的消毒以0.1%的HgCl2 处理12min 效果为好。在无菌苗子叶和下胚轴外植体脱分化形成愈伤组织的过程中, 2, 4-D 起主要作用, BA 起独特的作用。BA 与2, 4-D 配合使用对于愈伤组织的诱导和增殖具有良好的促进作用。高浓度的2, 4-D 或低浓度的2, 4-D 与BA 配合使用都可抑制愈伤组织分化根。     

甜荞FeFUL2基因的克隆与表达分析

为了探索甜荞FUL同源基因参与花与籽粒发育调控的分子机制,该文采用同源克隆的方法从甜荞(Fagopyrum esculentum)长花柱和长雄蕊突变体(lpls)中克隆到1个长837 bp的FeFUL2基因(GenBank登录号为MG779493.1),其包含长690 bp的完整开放阅读框,编码1个由229个氨基酸残基组成的MADS-box转录因子。通过对FeFUL2进行分子系统发生、同源蛋白比对与转录因子结构分析,结果显示FeFUL2与核心真双子叶植物AP1/FUL亚家族转录因子中的euFUL进化系聚于1个进化分支,属甜荞euFUL型MADS-box转录因子,且包含1个57个氨基酸残基长的高度保守的MADS结构域、1个69个氨基酸残基长的次级保守的K结构域,其C末端转录激活区在序列长度和氨基酸残基组成上与其他euFUL型转录因子差异较大,但仍含有2个euFUL型转录因子特有的保守基元:FUL motif和paleo AP1 motif。用qPCR检测基因表达的组织特异性显示:FeFUL2基因在甜荞lpls突变体的根、茎、叶、花被片、雄蕊、雌蕊和发育4 d的幼果中均有表达,但其在花被片中表达量极显著高于该基因在其他器官中的表达量(LSD,P0.01)。综合转录因子的结构与基因的表达模式推测,FeFUL2基因与其他euFUL型基因的功能可能存在一定差异,其在花发育过程中可能主要参与甜荞花被片的发育调控。