Potato I型蛋白酶抑制剂 rBTI及其突变体的表达、纯化和活性研究

荞麦胰蛋白酶抑制剂(BTI)属于丝氨酸蛋白酶抑制剂Potato I家族,典型构象中有1段暴露在分子外侧的结合区,该区内P1′、P2、P6′与P8′位的氨基酸残基具有高度保守性.本文依据近期解析的rBTI晶体结构以及rBTI与胰蛋白酶复合物晶体结构信息,对rBTI 中的P2和P8′位氨基酸进行突变,构建了pExSecI- Bti-P44T 和 pExSecI-Bti-W53R 重组质粒,转入大肠杆菌 BL21（DE3）中进行表达,通过Resource Q阴离子交换层析和Superdex G 75 HR 10/300凝胶柱进行分离纯化后,测定了rBTI及其突变体对胰蛋白酶的抑制常数,以及它们对HepG2 细胞内的蛋白酶体和细胞增殖的抑制作用. 实验结果显示,rBTI 的44和53位分别突变为 Thr和Arg后,Ki 分别为2.91×10-9mol/L和2.97 ×10-7mol /L,前者较rBTI（Ki = 3.56×10-8 mol/L）降低1个数量级,而后者较rBTI升高1个数量 级.功能分析显示,rBTI及2种突变体对HepG2细胞内的蛋白酶体基本没有抑制作 用,但是它们都保留了对HepG2细胞增殖的抑制活性.这些结果揭示,作为一种特异的胰蛋白酶抑制剂,rBTI分子中的保守区域氨基酸残基虽然对胰蛋白酶的抑制作用有显著影响,但并不影响其抑制肿瘤细胞的增殖,仍能发挥其原有的生物学功能.     

不同杀虫剂对荞麦害虫西伯利亚龟象的毒力及作用机制研究

荞麦Fagopyrum esculentum Moench.是我国重要的杂粮作物,内蒙古是我国甜荞的主产区,西伯利亚龟象Rhinoncus sibiricus Faust是2013年在内蒙古地区新发生的严重为害荞麦的害虫,目前主要依靠化学杀虫剂进行防治.本论文主要研究了不同种类杀虫剂对西伯利亚龟象的毒力和作用机制.结果...     

AlCl3分光光度法测定荞麦种质资源中黄酮的研究

荞麦是黄酮的膳食来源之一。我国是世界保存荞麦种质资源最多的国家,为深入开发利用荞麦种质资源的功能成分,对AlCl3分光光度法测定荞麦种质资源黄酮含量的方法进行了研究,并对新收集的169份荞麦种质资源进行了测定评价。结果表明：①AlCl3分光光度法稳定性好,准确性和精密度高,偏差小,易于操作,适用于荞麦种质资源黄酮鉴定和评价;②苦荞种质资源黄酮含量的平均值、变异幅度、标准偏差分别为2．53％、1．94％～3．11％、0．2436,甜荞种质资源黄酮含量的平均值、变异幅度、标准差分别为0．13％、0．08％～0．21％、0．0273;苦荞种质资源黄酮含量的平均值约为甜荞的20倍。     

中国荞麦属（蓼科）一新种——密毛野荞麦

描述了蓼科一新种——密毛野荞麦（Fagopyrum densovillosum J. L. Liu）,本种与细柄野荞麦（F. gracilipes(Hemsl.) Damm. et Diels）相近似,不同在于植株全体密被白色直立长毛,茎枝较粗壮,节较密集,节间较短, 叶较大,长（0.9～）1.7～6 cm,宽（0.7～）1.2～5.1 cm,阔卵形,心形,阔心形,阔卵状心形,卵形,长卵形,三角状卵形或卵状三角形,在上面具细皱纹,明显小泡状突起,叶柄较长,长 (0.5～) 2.6～7.5 cm,果实较小,长1.8～2.5 mm,直径1.5～2 mm,易于区别。     

外源蔗糖和Ca2+对荞麦幼苗耐盐性的影响

以盐敏感荞麦品种‘TQ-0808’为实验材料,在100mmol·L-1NaCl胁迫下研究添加不同浓度蔗糖和Ca2+处理对荞麦幼苗耐盐性的影响。不同浓度的外源蔗糖和Ca2+处理均能明显降低盐胁迫下荞麦叶片的质膜透性和丙二醛(MDA)含量,明显增加荞麦叶片的超氧化物歧化酶(SOD)和抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性及净光合速率,且外源Ca2+处理的增加效果明显好于外源蔗糖处理。说明外源蔗糖和Ca2+处理能明显改善盐胁迫下荞麦幼苗的耐盐性,对盐胁迫具有较好的缓解作用,外源蔗糖和Ca2+处理的最适浓度分别为6mmol·L-1和20mmol·L-1。     

中国四川荞麦属（蓼科）一新变种——翅果密毛野荞麦

描述了蓼科一新变种——翅果密毛野荞麦[Fagopyrum densovillosum J. L. Liu var.pterocarpum J. L. Liuet X.J.Li],并绘制了形态图。新变种瘦果较大,长2.5～3mm,宽(2～)2.5～3mm,果棱上具翅,翅宽0.5～1mm,雄蕊长于雌蕊,从而区别于原变种密毛野荞麦(Fagopyrum densovillosumJ.L.Liu);另外,新变种全株密被短毛或长毛,茎枝较粗壮,红褐色,节较密集,叶片在表面具细皱纹和小泡状突起,雄蕊长于雌蕊,而又不同于齿翅野荞麦[Fagopyrum gracilipes(Hemsl.)Damm.et Diels var. odontopterum(Gross)Sam]。     

野生型和突变型荞麦蛋白酶抑制剂的活性比较及抗肿瘤功能分析

运用定点突变技术研究重组荞麦胰蛋白酶抑制剂(rBTI)的作用位点,先后构建了R45A-aBTI 和R45F-fBTI 两个突变体．抑制活性测定显示,aBTI 和fBTI 均丧失了胰蛋白酶抑制活性,却分别增加了对弹性蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的抑制活性,确定Arg⁴⁵为野生型rBTI 的作用位点．稳定性分析表明,rBTI、aBTI 和fBTI 均具有很高的热稳定性及酸碱稳定性．采用MTT 比色法分别检测野生型和突变型抑制剂对肿瘤细胞生长的抑制作用．结果表明,突变前后的3种抑制剂对HL-60 和EC9706 细胞的生长均显示出很强的抑制作用,并且具有明显的浓度依赖性和时间依赖性．通过研究不仅确定了rBTI 的作用位点,而且获得了两种新型蛋白酶抑制剂,且作用位点的改变并不影响其对肿瘤细胞的生长抑制作用．为进一步研究胰蛋白酶抑制剂的结构与功能的关系以及抗肿瘤药物的研制提供了新的思路．     

谷氧还蛋白rbGrx可延缓CL4176秀丽隐杆线虫中β淀粉样蛋白诱导的毒性

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）是一种与衰老相关的神经退行性疾病,其中β-淀粉样蛋白（β-amyloid,Aβ）诱导的细胞毒性被认为是其发病的主要原因。本文以Aβ转基因秀丽隐杆线虫CL4176为模型,研究了重组荞麦谷氧还蛋白（recombinant buckwheat glutaredoxin, rbGrx）对Aβ诱导的毒性和氧化应激的影响。结果显示,4 μmol/L rbGrx可以延长CL4176线虫平均寿命达20%左右,并增加衰老虫体运动能力约43.6%,延迟产卵高峰期1 d,同时可以有效延缓Aβ毒性诱导的瘫痪表型。进一步研究发现,在正常条件和Aβ诱导毒性时,rbGrx均能降低CL4176线虫体内活性氧（reactive oxygen species,ROS）水平,并上调SOD活性和GSH含量。另外,rbGrx下调Aβ mRNA水平44.1％,减少Aβ沉积量,并且明显上调热激因子1 hsf-1（2.01倍）和hsp-16.2（2.65倍）mRNA表达水平。这表明,rbGrx通过降低CL4176线虫体内的ROS水平和上调热激蛋白质的转录表达水平,降低CL4176秀丽隐杆线虫中Aβ诱导的毒性。结果提示,rbGrx可能具有预防AD的潜力。     

AtNHX1基因对荞麦的遗传转化及抗盐再生植株的获得

通过农杆菌介导法将拟南芥液泡膜Na /H 反向转运蛋白基因AtNHX1转入荞麦中,在2·0mg/L6-BA、0·1mg/LIAA、1mg/LKT、50mg/L卡那霉素和500mg/L头孢霉素的MS培养基上进行选择培养,从来源于864块外植体的36块抗性愈伤组织中共获得426棵再生植株(转化频率为4·17%)。经PCR、Southern印迹分析、RT-PCR和Northern检测,初步证实AtNHX1基因已整合至荞麦基因组中。用200mmol/L的盐水对转基因植株和对照植株进行胁迫处理6周,转基因植株能够生存,而对照植株死亡。用不同浓度的NaCl溶液处理转基因植株和对照植株,发现Na 及脯氨酸含量在转基因植株中的积累水平显著高于对照植株,而K 的含量在转基因植株中的积累水平低于对照植株。次生代谢产物黄酮类化合物芦丁在转基因植株根、茎和叶片中的含量也比对照植株明显要高。这些结果表明利用基因工程手段提高作物的耐盐性是可行的。     

AtNHX1基因对荞麦的遗传转化及抗盐再生植株的获得

通过农杆菌介导法将拟南芥液泡膜Na⁺/H⁺反向转运蛋白基因AtNHX1转入荞麦中,在2.0mg/L 6-BA、0.1mg/L IAA、1mg/L KT、50mg/L卡那霉素和500mg/L头孢霉素的MS培养基上进行选择培养,从来源于864块外植体的36块抗性愈伤组织中共获得426棵再生植株（转化频率为4.17%）。经PCR、Southern印迹分析、RT-PCR和Northern检测,初步证实AtNHX1基因已整合至荞麦基因组中。用200mmol/L的盐水对转基因植株和对照植株进行胁迫处理6周,转基因植株能够生存,而对照植株死亡。用不同浓度的NaCl溶液处理转基因植株和对照植株,发现Na⁺及脯氨酸含量在转基因植株中的积累水平显著高于对照植株,而K⁺的含量在转基因植株中的积累水平低于对照植株。次生代谢产物黄酮类化合物芦丁在转基因植株根、茎和叶片中的含量也比对照植株明显要高。这些结果表明利用基因工程手段提高作物的耐盐性是可行的。