沉默抑制子CMV 2b基因的克隆及其反向重复植物表达载体的构建

从安徽亳州采集表现明显CMV症状的烟草样本,取ELISA检测阳性反应最强的样本提取总RNA。设计特异性引物扩增CMV RNA2部分片段,克隆并测序。其中包含的2b基因全长336个核苷酸,编码111个氨基酸。将来源于安徽烟草的CMV 2b基因与其它CMV 2b基因进行序列比对,结果表明,来源于安徽烟草的CMV 2b基因与来源于韩国的2b基因AF033667的核苷酸序列相似性最高,达98.8%。构建2b基因系统关系树,也表明来源于安徽烟草的CMV 2b基因与AF033667亲缘关系最近。以安徽CMV 2b为模板,分别扩增大小约为300 bp的正向片段CMV 2b（r）和反向片段CMV 2b（i）。先后将反向片段CMV 2b（i）和正向片段CMV 2b（r）分别插入载体pSK-In所含intron两侧,获得重组质粒pSK-2b（r）-In-2b（i）。再将含intron的正反向片段插入pBIN438,最终得到含CMV 2b部分序列反向重复的植物表达载体pBIN-2b（r）-In-2b（i）。     

结核分枝杆菌ESXB-ESXA融合蛋白的表达及其作为检测抗原的初步应用

目的:探索一种大量表达结核分枝杆菌ESXB-ESXA融合蛋白的方法,分析其抗原性,评价其在结核抗体检测中的初步应用。方法:采用PCR方法从结核分枝杆菌基因组中分别扩增esxB和esxA基因,用Linker(G4S)3连接2条目的片段,连接pET-32a(+)载体,构建ESXB-ESXA融合蛋白表达载体;重组表达载体转化宿主细胞大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达、纯化,Western印迹分析重组蛋白的抗原性;建立以融合重组蛋白为抗原的ELISA和胶体金检测方法,分析其在结核病抗体检测中的应用。结果:构建了ESXB-ESXA融合蛋白的表达载体,重组ESXB-ESXA在大肠杆菌中得以高效表达,表达量占菌体总蛋白的70%以上;Western印迹分析表明该重组蛋白具有较好的抗原性;ELISA和胶体金检测结果显示,用重组ESXB-ESXA抗原检测临床结核病患者有较好的特异性。结论:重组ESXB-ESXA融合蛋白表达量高并具有较好的抗原性,可作为结核病抗体检测的备选抗原。     

冲积平原区高程因子对土壤剖面质地构型的影响--以封丘县为例

河流冲积平原区土壤剖面质地构型对土壤水肥保持、供给能力以及水盐运动产生极为重要的影响。区域土壤的六大成土因素中,地形的影响最为突出。分析土壤剖面质地构型的地形影响,对于指导农业生产具有重要的理论与现实意义。本研究应用模糊c-均值算法模型,基于土壤剖面特征质地层厚度数据,得到研究区9种土壤剖面质地构型。对比分析典型区和研究区土壤剖面质地构型的地形影响结果表明：隶属于土壤剖面质地构型砂-砂-砂的隶属度值与高程之间始终存在正相关,说明地形较高部位发育的土壤质地偏砂的规律性始终存在,而从典型区到研究区,其它土壤剖面质地构型、0-60cm土层质地类型、以及表土层、心土层和底土层质地类型受地形影响的规律性减弱。地形较低部位发育的土壤剖面质地构型相对复杂,而地形较高处,发育的土壤剖面质地构型相对简单。土壤剖面质地构型复杂的地区可能更多地受到人为因素的干扰,从而表现出受地形影响的规律性不明显。     

一种来源于脆弱类杆菌的α-半乳糖苷酶的理化性质及其酶解B型红细胞的工艺研究

利用α-半乳糖苷酶去除红细胞表面的B抗原是制备通用O型红细胞的有效方法.本文在克隆表达纯化脆弱类杆菌来源的α-半乳糖苷酶的基础上对其理化性质进行了研究,该酶的分子量为64908Da,等电点在7.12～7.30之间,最适温度为41℃,最适pH为5.6～6.0,其理化性质适合用于B型红细胞的血型改造;为了确定高效、快速、温和的酶解条件,本文对酶解B型红细胞的工艺进行了优化.通过研究缓冲液对酶与红细胞结合的影响,确定了最佳酶解缓冲液为250mmol/L甘氨酸和3mmol/LNaCl,pH6.8;酶解的最适红细胞压积为40%,酶解温度为26℃,酶解时间为1h.利用优化的酶解工艺获得的B-ECORBCs形态及结构功能指标均正常,流式细胞结果证明其B抗原和H抗原标记率与O型红细胞相当,说明制备B-ECORBCs的工艺已成熟.这种工艺具有酶用量少、酶解条件温和、制备过程简单和时间短等优势,具有很好的临床应用前景.     

武夷菌素产生菌Fosmid文库的构建及文库探针的获得

以不吸水链霉菌武夷变种CK-15为材料,提取基因组DNA,经Sau 3A Ⅰ部分酶切后回收35-40 kb之间的片段,连接到pCC1FOS载体上,经过包装转染涂布后构建得到了CK-15基因组的Fosmid文库,文库的滴度为8.8×105CFU/mL.随机挑取16个阳性克隆,经EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切电泳分析,样品插入片段平均长度大于35 kb,插入率为100%,符合构建文库的要求.根据多氧霉素、尼克霉素生物合成基因及大环内酯类聚酮合成酶基因(PKS)设计特异性引物,以基因组为模板进行PCR扩增,筛选特异性引物探针.结果用大环内酯类聚酮合成酶基因设计引物扩增出1 693 bp的片段经Blast比对其与大环内酯类抗生素生物合成基因相似性为95%以上.武夷菌素产生菌CK-15 Fosmid文库的构建及文库探针的获得,为武夷菌素生物合成基因的克隆奠定了基础.     

髓鞘碱性蛋白片段69-85诱导建立大鼠自身免疫性脑脊髓炎模型

目的探索以大鼠髓鞘碱性蛋白片段69-85（MBP69-85）为单一抗原,建立Wistar大鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）模型,并观察其病理改变。方法MBP69-85以生理盐水溶解,与完全福氏佐剂（CFA）充分混匀制备免疫乳剂;雌性Wistar大鼠70只,留取10只作为正常对照组,余者根据免疫乳剂组分的不同随机分为A、B、C组（n=20）。A组：MBP69-85每只50μg＋CFA（含卡介苗6 mg）;B组：MBP69-85每只25μg＋CFA（含卡介苗6 mg）;C组：MBP69-85每只25μg＋CFA（含卡介苗12 mg）。脑和脊髓组织切片进行HE染色,MBP及神经微丝（neurofilament,NF）免疫组化检测,观察神经组织的病理改变。结果A组内部分大鼠在免疫后第12-16天发病,表现为尾部及四肢无力或麻痹、斜颈等,平均临床症状评分为2.38±1.89;B、C组均未见发病;HE染色可见神经组织内炎细胞浸润,血管＂袖套＂样病灶形成;MBP及NF免疫组化染色显示病变组织内白质脱髓鞘及轴突损伤明显。结论EAE模型建立与免疫抗原的剂量有一定的依赖关系;佐剂中的卡介苗含量不是诱导大鼠发病的主要原因;本模型具有多发性硬化的典型临床表现及病理改变,是研究多发性硬化发病机制及治疗的可靠的动物模型。     

东莞市东部工业园水生态环境质量评价

对东莞市东部工业园水系的浮游藻类、浮游动物、底栖生物和水质物理化学指标进行调查和评价.3个断面共监测到浮游藻类6门56属71种;浮游动物3个门共14种;底栖动物5种.利用叶绿素a、藻类数量单项指标、生物多样性指数和水质的理化指标对水系各断面水质进行综合评价,结果显示:东引运河横沥断面和企石排污口断面水体属于中度污染,而常平排污口断面污染严重且存在较强的非营养型污染:河流沉积物污染较水体污染严重;对水体的理化污染监测分析结果与生态评价相吻合,生态评价具有较好的准确性和灵敏性.因此,工业园区的建设与运营应严格做好废水的处理工作,有效保护工业园区水系的生态环境.     

土壤模糊隶属度不同数据转换方法及其对空间插值结果的影响

应用模糊c-均值算法对土壤进行连续分类时,其输出的土壤模糊隶属度值具有成分数据的结构特点.直接基于土壤隶属度数据实施普通克里格插值,其空间预测结果缺乏可信度.因此,在进行插值预测之前,必须对土壤模糊隶属度值进行必要的数据转换.研究采用对数正态变换方法、对称对数比转换方法和非对称对数比转换方法对土壤模糊隶属度值进行数据转换,分析了各种数据转换形式对插值结果及其精度的影响.结果表明,对样点土壤模糊隶属度进行简单对数正态转换,其插值结果空间上任意点的土壤对于不同类别的隶属度之和均不为1,因此这样的插值结果理论上缺乏可行性.数据经非对称对数比转换和对称对数比转换后,插值结果均满足各个位置组分之和为1和非负限制,二者相比,后者对区域总体趋势的反映较前者好,且精度较高.因此,在应用对称对数比方法对样点土壤模糊隶属度值进行数据转换的基础上,应用克里格技术实施空间插值可以获得最佳预测结果.     

4种桫椤初生叶的形态发育及其系统学意义

用腐叶土培养海南白桫椤(Sphaeropteris hainanensis)、阴生桫椤(Alsophila latebrosa)、刺桫椤(A.spinulosa)和滇南桫椤(A.austroyunnanensis)的孢子,获得有性生殖苗.观察并比较了幼孢子体最初4枚叶片形态发生的详细过程,据此讨论了其种属划分的合理性及相关的系统学意义.     

恶性疟原虫乳酸脱氢酶基因的克隆表达及表达产物免疫原性的鉴定

目的：克隆表达恶性疟原虫（Hasmodium falciparum,p．f）海南株（FCC1／HN）乳酸脱氢酶（LDH）,并对其免疫原性进行鉴定．为制备抗LDH抗体用于胶体金法快速检测疟原虫奠定基础。方法：应用PCR技术对恶性疟原虫乳酸脱氢酶（LDHpf）基因进行特异性扩增,将扩增产物克隆入表达载体pET-32a（＋）,重组表达载体经鉴定后诱导表达;重组LDHpf（rLDHpf）经纯化后,免疫家兔制备兔抗rLDHpf免疫血清,间接免疫荧光和Western印迹鉴定表达产物的免疫原性。结果：构建了pET-32a／LDHpf重组表达载体,测序后同源性分析显示p．f不同株间LDH氨基酸序列同源性大于98％,不同种间同源性也在90％以上;间接免疫荧光和Western印迹分析显示rLDHpf具有较好的免疫原性。结论：LDHpf基因高度保守;rLDHpf得到高效表达并具有良好的免疫原性。