癌基因EJ－ras在小鼠胚胎干细胞（ES－5）中的表达及其对ES－5细胞一些特征的影响

转基因动物在研究基因的功能、医药、畜牧业等方面有重要的应用。利用胚胎干细胞（ＥＳ）制作转基因动物,比传统的显微注射法有无可比拟的优点。但是,目前、只在小鼠中建立起了ＥＳ细胞系,在其它哺乳动物（包括家畜）中尚未建成。近来,人们开始探索：改变胚胎细胞的遗传物质（如：把外源基因导入胚胎细胞）是否有利于获得ＥＳ细胞系．在各种外源基因中,癌基因是值得尝试的基因。因为：（１）ＥＳ细胞的建系是使胚胎的ＩＣＭ细胞永生化的过程;（２）在体外利用癌基因转染可使许多原代培养细胞永生化;（３）ＥＳ细胞高表达一些原癌基因。我们用癌基因ＥＪ－ｒａｓ转染小鼠ＥＳ细胞,观察其对ＥＳ－５细胞一些特性（增殖、嵌合能力）的影响,以便选择合适的癌基因用于家畜ＥＳ细胞的建系。ＥＳ－５细胞通常培养在丝裂霉素处理的小鼠胚胎成纤维细胞（ＭＥＦ）上（Ｆｉｇ．Ａ）。转染用ＥＳ－５细胞培养在无饲养层细胞的、含有大鼠肝细胞（ＢＲＬ）的条件培养液ＤＭＥＭ中。ＥＪ－ｒａｓ基因克隆在真核表达载体ＰＳＶ２ｎｅｏ的ＢａｍＨＩ位点上、使用磷酸钙法转染ＥＳ－５细胞,Ｇ－４１８法筛选阳性克隆,得到的抗性克隆仍以集落形式生长（Ｆｉｇ．Ｂ）,选取５个较好的克隆（ＥＳ－ｒａｓ１,２,     

鲤鱼线粒体tRNA^phe基因结构的特异性

在脊椎动物线粒基因组的研究中。迄今为止已测定了人、牛、大鼠、爪蟾、鲸鱼、海豹、鸡等动物线粒体基因组的全序列。结果表明,脊椎动物线粒体基因组结构排列非常紧密。22个tRNA基因分布于结构基因和rRNA基因之间,并随其临近的基因一起转录,随后被精确地剪切焉,继续加工成熟。线粒体tRNA与细胞质tRNA相比有许多不同之处,如D环碱基数明显减少：TψC环中缺少T54－C－Pu－A序列：且各个臂上有高比例的碱基错配;同时在线粒体rRNA中A＋U含量很高。目前有报道指出线粒体中某些tRNA三叶草结构的变化与物种的进化相关联,但这一说法是否具有普遍性尚须探讨。我们最近完成了鲤鱼线粒体tRNA^phe基因的结构分析（图一）,并将其与上述已报导的几种脊椎动物粒体tRNA^phe基因进行了比较（表一）,发现这些tRNA^phe基因的D臂上都存在一个13bp的强保守区,而其它21种线粒体tRNA基因上的这一区域都是最不保守的。我们将此保守区前7个碱基与真核生物RNAPollIII识别的A区相比较,发现RNAPolIII识别的A区的3个强保守碱基在大事箕类型与碱基排列位置上完全与此保守区相同（图二）。考虑到tRNA^phe基因在线粒体基因组上位于置换环区和线粒体rRNA基因编码区之间这一特殊区域内,这种结构上的特殊性暗示着tRNA^phe基因与其它tRNSA基因在功能上存在着差异。鲤鱼线粒体tRNA^phe基因位于D环与12sRNA基因之间,由重链编码,长度为67bp,同哺乳动物线粒体tRNA基因一样,也不编码3′端的CCA序列。鲤鱼线料体tRNA^phe基因G＋C／A＋U＝0．76,可见其A＋U含量明显高于细胞质tRNA,从其二级结构上看,其氨基酸臂富含GC 对,存在二个错配碱基对,TψC环无TψC序列,T茎也有高比例的错配,且无细胞质tRNSA中特有的那组G－C对,D环由6个碱基组成,其D臂完全互补配对。在已知种类的线粒体其他tRNA基因结构中,反密码环最为保守,其次为氨基酸臂,D环和T环及其相应的臂最不保守。但是在tRNA^phe基因中最保守的却是D环的臂。这种tRNA^phe基因结构上的不寻常性,显示了其功能上的不寻常性,目前人们普遍的看法是线粒体tRNA^phe基因在其转录过程中,还起着识别转录本加工信号的作用,但这一过程的细节目前还不甚清楚。从结构上看,tRNA^phe基因 位于线粒体基因组D环一侧,而D环上具有重链复制启动始点和重链轻链转录调控区。在绝大多数由重链编码的基因中,tRNA^phe基因是被首先转录的基因,同时也是在各种成熟RNA转录本中,必须被剪切下来的tRNA。由此可见tRNA^phe基因在转录水平以及转录后的加工水平上均具有特殊的调控作用。我们推测脊椎动物tRNSA^phe其D臂上强保守结构的存在,也正是这种作用的一种反映。关于tRNA^phe基因结构与功能的关系及其表达调控特性的研究正在进行中。     

朱顶红精细胞超微结构观察

精细胞是双受精作用的直接参与者,是生殖生物学中的重点研究对象之一。以往的研究表明,应用连续超薄切片和计算机辅助三维重组技术,结合免疫荧光定位,发现两个精细胞在体积和细胞器含量上存着差异,即精子的二型性,而且与营养细胞核三者构成紧密功能单位却雄性生殖单位（MGU）。微管对精细胞的性状的确定、运动和维持MGU的动态结构稳定具有重要的作用。本文应用透射电镜。详细观察了朱顶红花粉管中细胞的超微结构,并着重微管结构及其分布的观察。朱顶红成熟花粉为两细胞型。成熟花粉于26℃、黑暗条件下,在液体培养基（含10％蔗糖和100ppm硼酸）中培养13－18小时,然后收集花粉管,固定,供电观察并照相。朱顶红成熟花粉培养13小时后,生殖细胞在花粉管中完成核分裂和胞质分裂等两个过程。形成两个精细胞。形成的两个精细胞前后排列,营养核前导并靠近花粉管顶端。领头的精细胞的细胞质以很大的表面与营养核相互融合（图版1－1,2）,有时营养核与两个精细胞彼此穿插、缠绕（图版1－3）。两精细胞之间的壁上具有多胞质通道和含均质电子密度中等的基质（图版II－4）。精细胞质在核与共同壁之间的区域染色较深,经高倍放大,观察到此处含丰富的微管, 自由分布,但以纵向或斜向为主（图版II－5,6）。所有的微管构成松散的桶状网络存在于两精核之间,除此之外,其他区域无微管分布（图版II－7）。培养18小时之后,两精细胞的共同呈网状（图版II－8）,此时微管均成纵向排列,平行于细胞长轴,构成筐状结构包围状精核,但不构成紧密的束状,证明了前人的免疫荧光观察结果。从以上观察结果我们可以得出如下的结论,朱顶红花粉为两细胞型,因此在花粉管中形成的两个精细胞一般前后排列,跟在营养细胞后面,这种线状排列方式在其他植物中也观察到,可能有利于三者作为一个结构功能单位在花粉管中移动和对花粉管狭窄空间的进化适应。MGU形成得较晚,在生殖细胞和营养核进入花粉管后才形成,并一直维持到精核形成,与其他报道不同。精细胞发育过程中,微管的分布方式变化显著。精细胞中微管的分布仅限于共同的细胞壁和靠近茎核之间的区域,总体构成一个松散的桶状结构。精细胞发育后期,微管均成纵向排列,包围着精核,极似生殖细胞筐状的微管结构形式。     

转基因猪外源生长激素基因的定位研究——非同位素标记染色体原位杂交技术

近几年来发展起来的染色体原位杂交技术是进行基因定位研究的重要手段。它为进一步进行基因定点整合研究提供依据。本文采用非同位素标记染色体原位杂交技术对经显微注射得到的转基因猪进行了内源和外源猪生长激素(PGH)基因在染色体上定位的研究。 用BhlI对pSMTPGH注射基因(本室制备)进行单酶切,选取3.5kb片段以Dig进行标记。为了提高灵敏度,我们采用了胶体金标记抗体技术并结合使用银增加试剂。利用染色体的组型分析,对杂交点的分布进行了统计学分析,发现内源PGH基因位于12p~(11),与国外Thomsen,P.D.等报道的一致。插入的外源PGH基因呈随机分布,但对某一转基因猪来说,外源基因的插入是集中在某一染色体上。这一结果的发现为进行转基因猪外源基因定点整合提供了依据,也为研究外源基因整合位点和转基因猪表观性状的关系准备了条件。     

尖体注射导入的人生长激素融合基因在小鼠乳腺中的暂态表达

以牛asl－酪蛋白基因的5′端及上游区3．4kb和3′端及下游区3．5kb作为调控元件,以人生长激素基因作为报告基因构建了融合基因,通过乳腺,心脏注射到小鼠体内,利用放射免疫分析方法（RIA）在泌小鼠的乳汁中检测到了表达的人生长激素,表明融合基因的构建是正确的。并由此建立了通过靶组织注射结合心脏注射对融合基因的构建无地自容伯快速简便方法,其中通过心脏注射而于乳腺获得特异性表达的实验结果尚未见报道。     

经济动物的基因工程

基因工程的研究在我国已经列入重点规划之中,是当代世界生物学研究中既有理论价值又有实践意义的一项研究工作,我国在1982年至1986年中预备进行乙型肝炎疫苗和口蹄疫苗的研制和初试。1984年7月1日在北京成立了中国生物工程开发中心顾问委员会,说明我国对产物工程的研究已经提到议事日程上来了。我们于1984年开始进行牛的生长激素基因克隆,并利用这些克隆基因在培育家畜中发挥它促生长及促乳的作用,从而培育经济动物的新品种。     

第三章 作为克隆载体的质粒

质粒的基本性质 质粒被广泛用作克隆载体。在本文讨论质粒的应用之前,回顾质粒的一些基本性质是合适的。质粒是复制子,能在染色体外稳定地遗传。应该强调的是,染色体外的核酸分子不一定是质粒。因为上面的定义含意是:遗传的同质性、单体的分子大小恒定、有能力独立于染色体而进行复制。因此,在巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)中发现的     

不同纲动物间的细胞核移植——将小鼠细胞核移到泥鳅细胞质中

我们以前的细胞核移植工作^[1,2]表明：移核卵早期胚胎发育模式(主要指卵裂速度及卵裂模式)与受体卵相同,而与供体核种类无关;供体与受体之间亲缘关系的远近及染色体数目的差异程度,对移核卵囊胚以后的发育有重要影响,但对不同组合间细胞核移植所得囊胚比例影响较小。由此我们可以假定,移核卵最初发育的启动及囊胚以前的发育主要与受体卵有关,而和供体与受体之间亲缘关系的远近关系不大。为了进一步验证这一理论并寻找除染色体数目⑵以外其它影响移核卵囊胚以后发育的因素,在本实验中,我们选择了小鼠(图版Ⅰ—A)和泥鳅(Ⅰ—B)即不同纲间动物作为细胞核移植的材料。     

不同纲动物间的细胞核移植——将小鼠细胞核移到泥鳅细胞质中

我们以前的细胞核移植工作［１,２］表明：移核卵早期胚胎发育模式（主要指卵裂速度及卵裂模式）与受体卵相同,而与供体核种类无关;供体与受体之间亲缘关系的远近及染色体数目的差异程度,对移核卵囊胚以后的发育有重要影响,但对不同组合间细胞核移植所得囊胚比例影响...     

用原位杂交法定位猪乳铁蛋白基因于染色体2q^12

本研究以非放射性标记的猪乳铁蛋白（Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｌｉａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ简称ＰＬＦ）ｃＤＮＡ为探针,通过染色体原位杂交法,对ＰＬＦ基因了染色体进行了染色体定位。实验中采用金胶抗体技术并结合使用银增强系统,提高了方法的灵敏度。利用染色体的组型分析,对杂交点的分布进行了统计学分析。５２％（２６／５０）的分裂相在第２号染色体具银粒分布,实验结果表明：ＰＬＦ基因定位于猪２号染色体２ｑ＾１２区域。