马链球菌透明质酸合成酶基因的分子克隆及表达

根据Streptococcus equisimilis、Streptococcus pyogenes、Streptococcus uberis三种链球菌透明质酸合成酶(seHAS、spHAS、suHAS)基因的高度保守区,设计一对简并引物,用两次PCR从Streptococcus equi的总DNA中扩增出sqHAS基因。构建表达质粒pSE-sqHAS并转化大肠杆菌DH5α,诱导培养后在细胞膜中检测到sqHAS蛋白及活性。利用携带该酶的细胞膜以UDP-GlcA和UDP—GlcNAc为底物在体外合成了分子量为3.6×10~6Da的HA,分别是发酵法生产和提取法生产的HA的分子量的2.5倍和5倍左右。马链球菌透明质酸合成酶基因的克隆及表达,国内外文献尚未见报道。本研究为体外酶法生产透明质酸做了初步探索。     

台湾家白蚁内切葡聚糖酶活性中心氨基酸的饱和突变

对内切葡聚糖酶的功能改进一直是纤维素酶研究领域的焦点。本研究对台湾家白蚁内切葡聚糖酶(CfEG)的活性位点做了饱和突变。首先,以PDB数据库中高山象白蚁内切葡聚糖酶(NtEG)的三维结构(PDB id=1ks8)为模板,对CfEG进行三维结构同源建模,二者序列一致性高达79%。位于CfEG活性中心的D53、D56、E411,分别与NtEG的催化残基D54、D57、E412重合。用简并引物对CfEG的假定活性位点D53、D56、E411进行定点饱和突变。在位点D53、D56各筛选到羧甲基纤维素酶活有一定提高的突变子D53E、D56C,其中D56C的Km值减小为原始酶的三分之一。双突变子D53L/D56I的比活比原始酶提高了近2倍,同时Km值减小至原始酶的一半。而E411的饱和突变子库均没有活性,进一步将其替换为近似氨基酸的E411D、E411Q定点突变子也丧失了酶活。由突变结果可推断,位点E411为该酶行使功能的必需残基。     

弗氏柠檬酸菌dhaT基因的克隆表达、序列分析、酶的纯化及特性研究

1,3-丙二醇（1,3-propanediol,1,3-PD）是一种重要的化工原料,越来越受到广泛的关注。以弗氏柠檬酸菌(Citrobacter freundii)基因组DNA为模板,通过PCR得到1,3-丙二醇氧化还原酶(1,3-propanediol dehydrogenase,PDOR) 的基因dhaT,序列显示与来源于C.freundii DSM 30040 (Genbank U09771)相应基因的相似性为78%。将此基因构建于表达载体pSE380,得到重组质粒pSE-dhaT。重组质粒转化到宿主菌E.coli JM109中进行了表达,重组酶通过镍柱及Sephacral S-300进行纯化,重组酶SDS-PAGE结果显示有非常明显的单一的42kDa特异性蛋白条带出现。以丙醛为底物测定重组酶还原反应的最适温度为37℃、最适pH为8.0,对丙醛的Km值为10.05mmol/L,最大反应速度Vmax为37.27umol/ min /mg;以1,3-PD为底物测定重组酶氧化反应的最适温度为25℃、最适pH为10.5,对1,3-PD的Km值为1.28mmol/L,最大反应速度Vmax为25.55umol/min/mg。重组酶的还原反应比活为49.50U/mg,氧化反应比活为79.72U/mg。该酶同样具有假定的结合Fe2+的G-X-X-H-X-X-A-H-X-X-G-X-X-X-X-X-P-H-G模体保守结构。此研究为工程菌高效生产1,3-PD奠定了基础。     

富集宏基因组DNA中α淀粉酶全长基因的克隆及重组表达

利用反向-巢式PCR（IN-PCR）从富集土壤宏基因组DNA中克隆到一种α-淀粉酶基因的全序列,其基因登录号为GU045523,测序分析显示与来自Bacillus sp. KR-8104耐酸淀粉酶不完整基因同源性为99%。将获得的α-淀粉酶成熟肽基因与表达载体pSE380连接,导入Escherichia coli JM109中,IPTG诱导表达。粗酶液经Ni-NTA、Sephacryl S-200纯化后测定酶学性质：重组酶GXAA的最适作用pH为7.0,最适作用温度为75℃,对可溶性淀粉的Km值为11.6g/L。构建突变子E27G、A450T、E27G-A450T,其酶学性质与原始酶没有显著差别。     

谷氨酸棒杆菌海藻糖合成酶基因的克隆及功能鉴定

利用生物信息学手段,在GenBank数据库进行氨基酸的同源性检索分析,发现来自谷氨酸棒杆茵(Corynebacterium glutamicum)一功能未确定的ORF序列被注释为假设的海藻糖酶(putative trehalose sesynthase),它与已报道的海藻糖合成酶的氨基酸序列有60％以上的同源性。本研究把这段ORF克隆到大肠杆茵进行表达及进行功能鉴定。实验表明这段ORF序列为一新的海藻糖合成酶基因,其表达产物能将麦芽糖分子转化成海藻糖分子。重组酶性质的初步研究表明重组酶在pH7．0～7．5,30℃转化麦芽糖效率最高。     

甘蔗乙烯合成酶基因家族三个成员的克隆与序列分析

ACC（1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid）合成酶是高等植物乙烯生物合成途径中的限速酶.根据已克隆的植物ACS（1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid synthase）基因同源序列,设计简并引物,以甘蔗叶片总DNA为模板,通过PCR扩增,得到3条特异性强的扩增片段：Sc-ACS1为1 041 bp、Sc-ACS2为1 345 bp和Sc-ACS3为1 707 bp.将序列在GenBank核酸数据库进行同源性搜索,结果表明,3个片段均为ACS基因,推导编码的蛋白质序列分别包含326、242和310个氨基酸.其中,Sc-A CS1和Sc-ACS3同源性最高,核苷酸序列和蛋白质氨基酸序列分别有98%和96%同源,与禾本科植物玉米Zm ACS6、水稻OS-ACS2、毛竹等ACS基因家族也有很高的同源性,核苷酸序列同源性为88%-98%,蛋白质氨基酸序列同源性为73%-81%.甘蔗Sc-ACS2与水稻OS-ACS5在核苷酸和氨基酸序列上分别有91%和79%同源性,但与甘蔗Sc-ACS1和Sc-ACS3基因成员之间,氨基酸同源性分别只有45%和49%.系统进化分析表明,Sc-ACS1和Sc-ACS3基因与玉米Zm ACS6基因亲缘关系最近,而Sc-ACS2基因与水稻OS-ACS5基因亲缘关系最近.Southern杂交表明三基因在基因组中确实存在而且是多拷贝基因.三个片段已在GenBank数据库中注册,注册号分别为AY620985、AY620986和AY788919.     

运动发酵单胞菌乙醇脱氢酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

采用PCR技术,以基因组DNA为模板克隆得到运动发酵单胞菌(Zyrnomonas mobilis)乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenaseⅡ)基因adhB,连接到表达载体pSE380上,得到重组质粒pSE-adhB。将此重组质粒转化到大肠杆菌菌株DH5α中,重组菌株经IPTG诱导后,在乙醛指示平板检测到乙醇脱氢酶活性。SDS-PAGE电泳结果显示出明显的40KD特异性蛋白质条带。重组菌株经诱导培养,每毫升发酵液酶活力为5u。     

克雷伯氏菌甘油脱水酶基因在大肠杆菌中的克隆与表达

利用PCR技术从克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae ATCC49790)总DNA中扩增得到甘油脱水酶(glycerol dehydratase,DHAB)基因的DNA片段,并将其连接到表达质粒pSE380,携带有重组质粒pSE-dhaB的大肠杆菌JM109实现了dhaB基因的表达;对含有dhaB工程菌进行表达研究,表明工程菌在37℃,以1．0mmol／L IPTG诱导5h酶活力即达到1164．14u／L,比野生菌酶活力(168．69U／L)提高了6．9倍。     

一种快速筛选海藻糖合成酶突变体体系的建立

利用λRed重组系统对大肠杆茵JM109的6-磷酸海藻糖合成酶基因OtsA和6-磷酸海藻糖酯酶基因otsB进行敲除,获得otsA和otsB基因失活的大肠杆菌突变体,该突变体由于对渗透压变得非常敏感,在舍5%NaCl和0.5%麦芽糖的培养基中生长缓慢,然而当导入有活力的外源海藻糖合成酶基因后,由于能在胞内合成海藻糖,增强了细胞抗高渗透压培养基的能力,因而可让otsA和otsB基因缺失后的JM109得以恢复其生长能力.通过比较它们在高渗透压的培养基中的生长速度,可以筛选出含有不同活力的海藻糖合成酶突变体.     

一株新型产淀粉酶中度嗜热菌的分离鉴定及酶学性质研究

用稀释分离法从广西象州温泉筛选分离到一株可水解淀粉的中度嗜热细菌GXS1,该茵株革兰氏染色为阳性,端生芽孢,细胞呈杆状,最适生长温度为60℃～65℃,最适生长pH为6.0～7.0.结合生理生化特征和16S rDNA序列分析,初步鉴定该茵株为Geobacillus sp.GXS1.对该茵所产高温淀粉酶的性质研究表明:酶的...