甘蔗ACC氧化酶基因片段的克隆与序列分析

1- 氨基环丙烷-1-羧酸（ACC）氧化酶是植物乙烯合成的一个关键酶,乙烯作为一种内源激素,对植物生长、老熟过程有多方面的调节作用。根据报道的各种植物ACC氧化酶氨基酸序列上前后两个保守区设计两个简并引物,以甘蔗总DNA为模板,通过PCR扩增到一个940bp的基因片段。将片段序列在MCBI的BLAST软件上进行同源性搜寻,显示的63个序列全部是ACC氧化酶基因,因而认为克隆到的片段就是甘蔗ACC氧化酶基因的一个成员。经对不同植物来源的ACC氧化酶基因家族进行比较分析,去除一个103bp的“内含子“后,推导的氨基酸序列为279个残基,占推测全长氨基酸残基总数的86％左右。经同源性分析,序列与毛竹和水稻ACC氧化酶的同源率达到86％。系统进化分析表明,该序列最先与水稻、其次和香蕉的ACC氧化酶聚类,然后再与双子叶植物的ACC氧化酶聚类,符合按形态特征分类的血缘关系。基因的获得对下一步了解乙烯的合成表达与甘蔗生长、成熟过程之间的关系奠定了基础。     

甘蔗ACC氧化酶全长cDNA的克隆及序列分析

ACC氧化酶是高等植物乙烯生物合成途径中的限速酶。根据报道的植物ACC氧化酶基因序列设计特异引物,从甘蔗cDNA文库中克隆到一ACC氧化酶基因片段,命名为GZ-ACO,该基因长792bp,与甘蔗基因组文库中克隆的ACO基因片段仅18个碱基之差。根据该cDNA片段序列,设计两对末端扩增的特异引物,利用RACE-PCR技术,获得GZ-ACO片段的5′端和3′端序列。用VectorNTI7.0软件对三个序列进行拼接和分析,结果得到全长的甘蔗GZ-ACO氧化酶基因。GZ-ACOcDNA核苷酸序列长1307bp,具有一个972bp完整的读码框,启动子ATG位于126bp,终止子TAA位于1097bp,推导编码323个氨基酸。系统进化分析表明,GZ-ACO基因氨基酸序列与其它植物已报道的ACC氧化酶基因具有65%~86%的同源率,且与单子叶禾本科植物首先聚类,其次与单子叶芭蕉科、兰科植物聚类,最后与双子叶植物聚类,与植物形态的系统进化结果一致。该基因已在DDBJ/EMBL/GenBank基因数据库注册,注册号为AY521566。     

牡丹ACC合成酶ACS1基因的克隆与原核表达

从牡丹‘洛阳红’(Paeonia suffruticosa‘ Luo Yang Hong’)花瓣中提取总RNA,根据GenBank上牡丹ACC合成酶基因PsACS的序列设计引物,通过RT-PCR获得牡丹PsACS1基因序列,包含一个1 479 bp的开放阅读框,编码492个氨基酸.将PsACS1基因cDNA片段与pET28a(+)构建原核表达载体pET-ACS1,转化大肠杆菌E.coli BL21 (DE3).0.4 mmol/LIPTG诱导3h后,在预期的蛋白分子量55 kD处出现1条表达加强的蛋白条带.为进一步目的蛋白的纯化和鉴定提供试验基础.     

柿果实ACC合成酶cDNA的克隆及其序列分析

根据其它植物ACC合成酶（1－aminocyclopropane-1-carboxylic acid synthase,ACS)氨基酸保守区,设计1组简并引物,用RT－PCR法,从柿（Diospyros kaki Thunb.)果实扩增出3个约1kb左右的cDNA片段,将其克隆至pGEM-T载体上,对这些重组克隆进行序列测定和氨基酸序列推导,DK－ACS1由1101个碱基组成,编码364个氨基酸;DK－ACS2是1086个碱基,编码359个氨基酸;DK－ACS3为1089个碱基,编码363个氨基酸。它们均具有其它植物ACS合成酶中存在的7个保守区和11个不变氨基酸残基,且在多肽水平上有较高的同源性。与番茄LE－ACS2的同源性DK－ACS1是60.5A%,DK-ACS2是70.7%,DK－ACS3为66．9％,与甜瓜CM－ACS1的同源性依次分别是60．4％,72．1％和64．4％。     

河套蜜瓜ACC合成cDNA酶片段的克隆和序列分析

１－氨基环丙烷－１－羧酸（ＡＣＣ）合成酶是高等植物中乙烯生物合成的关键酶。以成熟河套蜜瓜果实的ＲＮＡ为模板,经反转录和ＰＣＲ扩增得到预期大小的ＤＮＡ片段,插入到ＰＵＣ１９的ＳｍａＩ位眯后转化Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９,筛选出重组子ＰＨＭＡＳ１。离列分析表明获得了６２７ｂｐ的ＡＣＣ合成酶ｃＤＮＡ片段。与已报道的ＡＣＣ合成酶基因相应离理比较有很高的同源性。     

河套蜜瓜ACC合成酶cDNA片段的克隆和序列分析

1-氨基环丙烷-1-羧酸（ACC）合成酶是高等植物中乙烯生物合成的关键酶。以成熟河套蜜瓜（CucumismeloL．cvHetau）果实的RNA为模板,经反转录和PCR扩增得到预期大小的DNA片段,插入到pUC19的SmaⅠ位点后转化E.coliJM109,筛选出重组子pHMAS1。序列分析表明获得了长627bp的ACC合成酶cDNA片段。与已报道的ACC合成酶基因相应序列比较有很高的同源性．     

小苍兰ACC合成酶FhACS1基因的克隆与序列分析

以小苍兰品种“上农金皇后”为研究对象,利用PCR技术和染色体步移技术首次克隆到了ACC合成酶FhACS1基因的全长序列和编码序列。结果表明：FhACS1基因全长为2 576 bp,包含长为433 bp的5′端非编码区序列（5′-UTR）以及长为373 bp的3′端非编码区序列（3′-UTR）;开放读码框（ORF）长度为1 371 bp,推定编码457个氨基酸。分析表明,该基因包含3个内含子和4个外显子。序列分析结果显示,FhACS1推导蛋白具备ACS蛋白的7个保守结构域;在氨基酸水平上,FhACS1与小果芭蕉的同源性最高（85%）;系统进化分析表明,FhACS1与孟宗竹BaACS（BAC56949.1）、水稻OsACS1（AAA33888.1）、小果芭蕉MaACS1（AAQ13435）的亲缘关系最近。在其已知启动子区域,发现有多个对脱落酸、赤霉素、细胞分裂素等激素响应的顺式元件,以及对干旱和低温等逆境胁迫响应的顺式元件。     

决明查尔酮合成酶基因的克隆及序列分析

以决明(Cassia tora)为实验材料,利用RT-PCR和RACE技术,从决明嫩叶中克隆出查尔酮合成酶(Chal-one synthase,CHS)基因,其cDNA全长为1 459 bp,编码一个由390个氨基酸残基组成的多肽.氨基酸序列分析表明,决明CHS基因的氨基酸序列中含有44.61%的中性疏水氨基酸,29.74%的中性亲水氨基酸,12.56%的酸性氨基酸和13.O8%的碱性氨基酸.决明CHS基因的氨基酸序列中具有CHS家族酶系的氨基酸保守残基,包括结合底物CoA的结合残基及催化聚酮合成的催化残基,表明其可能参与聚酮化合物的合成.决明与其它植物CHS的氨基酸序列的进化分析表明,其与同为豆科决明属的翼叶决明(Cassia alata)的同源性较近,并且CHS家族可以分为CHS亚家族与非CHS亚家族.将得到的序列提交GenBank,登录号为EU430077.     

全雌系苦瓜ACC合成酶基因cDNA克隆及序列分析

以全雌系苦瓜‘X-Hei-d-d’花蕾为材料,根据已报道ACC合成酶(1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid synthase,ACS)保守氨基酸序列设计简并引物,采用RT-PCR技术及序列拼接,获得了全雌系苦瓜ACS基因cDNA序列,命名为Mc-ACS4(GenBank登录号:FJ459814)。该序列包含一个1 455 bp的完整开放阅读框,编码484个氨基酸,具有7个保守区;系统进化上与普通苦瓜ACS基因首先聚类,同源性达99%,二者仅有2个氨基酸差异,推测可能与全雌系苦瓜性别分化有关。     

毛竹萜类合成酶基因家族序列鉴定与表达分析

通过生物信息学方法,对毛竹(Phyllostachys edulis(Carrière)J.Houzeau)TPS基因家族的成员进行鉴定,并对其编码蛋白的理化性质、基因结构、进化关系、蛋白结构、启动子元件及表达模式进行了分析。结果表明,毛竹全基因组含有14个TPS候选基因,大小为693~2439 bp。编码蛋白等电点为5.08~8.17。系统发育分析结果显示,毛竹含有TPS-a、TPS-b、TPS-e/f、和TPS-g 4个亚家族,成员数目分别为6、5、2、1个。TPS蛋白质二级结构中,α-螺旋和无规则卷曲所占比重较大;毛竹TPS基因家族各成员蛋白三维结构比较相似。基因启动子分析共获得50个调控元件,可分为6大类,其中光响应相关元件数量最多,共包含17个顺式调控元件。基于转录组测序数据构建的基因表达谱热图分析结果表明,Pe TPS在叶、花和笋等7个组织中的表达差异明显,表现出组织特异性,其中Pe TPS9仅在早花期花序中表达,Pe TPS8仅在叶中表达。     

花生白藜芦醇合酶基因的克隆与生物信息学分析

利用Protparam、iPSORT prediction、ProtScale、SOPMA、Swiss-Modeling和Scan Prosite等生物信息学工具分别对其理化性质、信号肽、疏水性、亲水性、二级结构和三级结构进行分析。以花生粤油45总DNA和总RNA为模板,采用PCR和RT-PCR技术克隆花生白藜芦醇合酶基因的DNA和cDNA序列,并利用SWISS-PROT、DNAMAN等生物信息学工具对其基因和蛋白质序列进行了分析。测序结果显示,该基因的DNA和cDNA序列长度分别为1 498 bp和1 251 bp,cDNA序列具有完整的开放性阅读框,编码389个氨基酸的多肽。该白藜芦醇合酶氨基酸368-378位点上存在芪合酶家族的特征位点GVLFGFGPGLT。同源性分析表明,其碱基序列与已报道的花生白藜芦醇合酶基因的一致性为99%,其氨基酸序列与已报道的花生白藜芦醇合酶氨基酸序列的一致性为100%。     

黄独微型块茎鲨烯合酶的基因克隆与序列分析

通过黄独微型块茎转录组数据库筛选到SQS基因的核心片段,利用RT-PCR技术获得SQS基因保守片段,采用RACE技术获得SQS基因的3′及5′末端序列,并采用生物信息学方法进行序列分析。结果表明,黄独微型块茎SQS基因编码序列长1548 bp,编码415 bp的氨基酸序列,理论分子量为46786.38 D,等电点(pI)为5.97。SQS蛋白为疏水性蛋白,无信号肽,含有SQS所必需的功能结构域,属于Isoprenoid_Biosym_C1 superfami?ly。黄独SQS蛋白与其他植物的SQS蛋白同源性较高,其中与盾叶薯蓣的SQS蛋白氨基酸相似性为96.4%。本试验结果从黄独微型块茎中首次获得SQS基因cDNA全长序列,该基因具有SQS同源基因的典型特征,为进一步研究黄独微型块茎SQS基因结构、基因表达和基因突变提供了基础,并为薯蓣属植物三萜合成通路关键酶SQS的正选择位点与功能的关联性分析提供了数据支持。     

特异切割番茄 1-氨基环丙烷羧酸合成酶mRNA的核酶基因序列的合成与克隆

根据番茄1-氨基环丙烷羧酸合成酶(ACC合成酶)基因cDNA序列, 按照锤头状核酶作用模式, 设计合成长度分别为40mer和48mer的一对引物,经体外退火、延伸、连接,插入质粒pGEM-3Zf(+)的KpnI和BamHI位点之间,经菌落原位杂交、双酶切、聚丙烯酰胺凝胶电泳和序列分析证明,人工合成了特异切割ACC合成酶mRNA第667-669位点GUC序列的核酶基因序列。 Abstract:In order to interrupting the ACC synthase activity in tomato,a hammerhead ribozyme targeting to cleave GUC triplet at the position 667~699 of ACC synthase mRNA was established and integrated into KpnI and BanHI site of vector pGEM-3Zf(+).Four positive clones were gotten by in situ hybridization.The recombinatant plasmids were digested with restriction endonuclease KpnI and BanHI.By polyacrylamide gels electrophoresis and sequence analysis,the size and the sequence of one of the digested product was the same as those of what we expected.These results showed that the ribozyme gene sequence has been obtained.     

Expression of the Grifola frondosa Trehalose Synthase Gene and Improvement of Drought-Tolerance in Sugarcane （Saccharum officinarum L.）

Trehalose Is a nonreduclng dlsaccharlde of glucose that functions as a protectant In the stabilization of blologlcal structures and enhances stress tolerance to abiotic stresses in organisms. We report here the expression of a Grlfola frondosa trehalose synthase （TSase） gene for Improving drought tolerance In sugarcane （Saccharum offlclnarum L.）. The expression of the transgene was under the control of two tandem copies of the CaMV35S promoter and transferred Into sugarcane by Agrobacterium tumefaciens EHA105. The transgenlc plants accumulated high levels of trehalose, up to 8.805-12.863 mg/g fresh weight, whereas It was present at undetectable level in nontransgenlc plants. It has been reported that transgenlc plants transformed with Escherlchla coil TPS （trehalose-6-phosphatesynthase） and/or TPP （trehalose-6-phosphate phosphatase） are severely stunted and have root morphologlc alterations. Interestingly, our transgenlc sugarcane plants had no obvious morphological changes and no growth Inhibition in the field. Trehalose accumulation in 35S-35S：TSase plants resulted In In- creased drought tolerance, as shown by the drought and the drought physiological Indexes, such as the rate of bound water/free water, plasma membrane permeability, malondlaldehyde content, chlorophyll a and b contents, and activity of SOD and POD of the excised leaves. These results suggest that transgenlc plants transformed with the TSase gene can accumulate high levels of trehalose and have enhanced tolerance to drought.     

芜菁花青素合成酶基因的克隆、序列分析及表达

目的：克隆津田芜菁和赤丸芜菁花青素合成酶（ANS）基因并研究其表达特性。方法：用UV-A处理津田芜菁和赤丸芜菁块根24h后提取总RNA,通过RT-PCR方法克隆BrANS1和BrANS2基因并进行序列分析,通过Northern杂交检测BrANS1和BrANS2基因的表达。结果：BrANS1和BrANS2的开放读码框为1077bp,编码358个氨基酸残基;BRANS1和BRANS2与甘蓝ANS的同源性达97％,第211-307肽段具有20G-Fe（Ⅱ）加氧酶家族基因的结构域;BrANS1和BRANS2基因具有高度同源性,核苷酸序列在5个位置上存在差异,推导的氨基酸序列完全相同;uv-A可以诱导BrANS1和BrANS2表达,基因的表达量与处理时间相关。结论：克隆了津田芜菁和赤丸芜菁的BRANS1和BrANS2基因,这将为筛选依光型和非依光型花青素生物合成催化酶基因奠定研究基础。     

酿酒葡萄分支酸合成酶基因(VvCS)的克隆与表达分析

本研究以酿酒葡萄(Vitis vinifera)品种赤霞珠(Cabernet Sauvignon)及霞多丽(Chardonnay)为试材,采用in silico克隆和分子克隆相结合的策略,从果实中克隆到分支酸合成酶基因,命名为VvCS。该基因的cDNA编码区全长1312bp,编码436个氨基酸残基,预测其编码蛋白质分子量为46.9kD,等电点为7.8;生物信息学分析显示VvCS的DNA全长7117bp,包含13个外显子和12个内含子,定位于葡萄的第13号染色体上。VvCS编码的蛋白与其它植物来源的分支酸合成酶在氨基酸水平上的同源性为75%左右;实时荧光定量PCR分析表明VvCS在葡萄果实、茎、叶和叶柄组织中均有表达,且在果皮、果肉和种子中的表达变化趋势相似,与盛花后5周的果实相比,盛花后11周果实各部位中VvCS表达丰度均有不同程度增加。     

一个新的茶树黄酮醇合酶基因的克隆和表达分析

Cs—COR113（GenBank登录号：FE942098）为一受冷诱导的茶树黄酮醇合酶基因的cDNA片段,采用RACE技术克隆了这一基因的全长cDNA,命名为CsFLS（GenBank登录号：FJ577509）。CsFLScDNA序列全长为1303bp,5＇-UTR和3’-UTR分别长91bp和175bp,包含一个编码336个氨基酸的完整开放阅读框。序列分析显示,CsFLS与烟草、矮牵牛、欧芹、拟南芥的黄酮醇合酶的同源性分别为74％、75％、75％和63％,含有2-酮戊二酸依赖性双加氧酶家族2个保守的基序,以及与黄酮醇合酶正确折叠有关的2个保守的甘氨酸残基。CsFLS的表达受低温诱导,但不受ABA诱导。