特异性杀虫基因Bt cry3A在桑粒肩天牛幼虫两种肠道常驻内生菌中的转化和表达

[目的]将特异性杀虫毒蛋白基因Bt cry3A转入桑粒肩天牛(Apriona germari Hope,Ag)幼虫肠道常驻内生菌中,构建能在天牛幼虫肠道中定殖并表达特异性杀虫基因Bt cry3A的工程菌.[方法]以传统方法和16S rDNA分子生物学分析等方法分离、鉴定Ag幼虫肠道优势的常驻内生菌,从中筛选出适合转化的候选菌株.利用电转化技术将含有对鞘翅目昆虫具专一性毒力Bt cry3A基因的Escherichia coli-Bacillus thuringiensis穿梭表达质粒pHT305a和pHT7911分别转入Ag幼虫肠道常驻内生菌短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis Ag12,Ag12)和苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis Ag13,Ag13)中.[结果]从Ag幼虫肠道共分离获得18个不同种的可培养细菌菌株,并从中选取菌株Ag12和Ag13作为出发菌株转入Bt cry3A基因.经质粒稳定性试验、转化子生长特性测试、伴胞晶体电镜检测、毒蛋白SDS-PAGE分析、工程菌定殖性分析以及生物毒力测试,结果显示cry3A基因已经成功转入Ag幼虫的常驻内生菌短短芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌中,并且工程菌Ag12-305a、Ag13-305a、Ag 12-7911和Ag13-7911都能在天牛幼虫肠道内稳定生长、繁殖并表达分子量约65kDa的伴孢晶体杀虫蛋白Cry3A.[结论]Bt cry3A基因已成功转入桑粒肩天牛幼虫肠道优势常驻内生菌中,获得了四株能在桑粒肩天牛幼虫肠道内定殖,并能表达目的杀虫基因Btcry3A的转基因工程菌.     

饲喂四环素和链霉素对贡嘎蝠蛾幼虫生长和肠道消化酶的影响

以抗生素(四环素和链霉素)处理的食物饲喂贡嘎蝠蛾Hepjalus gonggaensis Fu & Huang,sd.nov.4龄幼虫1个月后,肠道主要消化酶的种类和酶活都发生了显著变化。经测定知,淀粉酶和蛋白酶是4龄幼虫主要的消化酶,其次为海藻糖酶、麦芽糖酶和纤维素酶。经抗生素处理的食物饲喂后,与正常对照相比,抗生素处理的幼虫体重增长百分比显著降低(P<0.01),所测的消化酶酶活比对照也显著降低(P<0.01)。另外,肠道内原有的半纤维素酶和纤维素酶在抗生素处理后没有检测出酶活。据此认为,抗生素可能对幼虫生长有毒害作用。其原因可能是抗生素长期使用导致肠道菌群紊乱,消化生理发生改变,从而导致一些消化酶活性下降甚至完全失去活性。     

耐低水活度高毒力虫生真菌菌株选育*

以球孢白僵菌Ｂｅａｕｖｅｒｉａ　 ｂａｓｓｉａｎａ和玫烟色拟青霉Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ　ｆｕｍｏｓｏｒｏｓｅｕｓ为研究对象,利用紫外线诱变芽生孢子和低水活度条件胁迫筛选,选育出突变株Ｂｂ０７２４０、Ｐｆ０１１２０和Ｐｆ０１１６０,它们在低水活度（或相对湿度）下的生长和萌发均明显优于其相应的初始菌株。生物测定表明,突变株对桃蚜的毒力明显高于其初始菌株。     

优化重叠PCR法进行单链抗体基因扩增和点突变

利用重叠PCR技术扩增单链抗体基因或位点突变是抗体文库构建或稳定表达的关键和难点,国内外文献未见其方法学的系统报道.以不同VH、VL和Linker基因为拼接模板进行重叠PCR,针对影响重叠PCR扩增的拼接类型,引物设计,反应条件等进行优化.结果表明两段重叠连接比三段更容易实现,且扩增效果好;引物的互补序列长度一般应大于15 bp,且在18～24 bp 时扩增效果最好;退火温度在52～60℃,Mg2+浓度在1.5～2.5 mM时对拼接的效果影响较小;直接或间接使用拼接模板均可以实现重叠PCR的扩增.利用优化策略,首次构建了抗除虫菊酯的scFv基因文库并引入抗XAC糖蛋白scFv基因的点突变,为除虫菊酯抗体文库构建和抗XAC重组抗体的稳定表达奠定了基础.     

三重RT-PCR同步检测马铃薯多种病毒影响因素

根据病毒外壳蛋白区序列设计PVX、PVS特异性引物对,根据P1基因区序列设计PVA特异性引物对,应用三重RT-PCR同步检测马铃薯X病毒,马铃薯A病毒及马铃薯S病毒,分别得到562bp、255bp、182bp大小的扩增片段。试验从反转录反应、PCR反应及循环条件3方面讨论了试剂和循环条件对三重RT-PCR同步检测3种病毒的影响。结果表明反转录反应中dNTPs浓度、3种病毒下游引物浓度比例对整个反应影响较大;其次是PCR反应中MgC12浓度和退火温度;反转录时间,循环条件对RT-PCR影响较小。     

基于16S rDNA序列的柑桔木虱体内共生菌多样性研究

昆虫消化道内是一个复杂的微生态系统,有大量的微生物存在.这些微生物对寄主发育、营养吸收和防御方面都起着重要的作用.本文利用基于16S rRNA基因的PCR-RFLP指纹图谱法和变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)的方法对柑桔黄龙病虫-媒柑桔木虱Di...     

绿色荧光蛋白基因原核表达载体的构建及其在昆虫肠道短短芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌中的表达

【目的】构建带有苏云金芽孢杆菌cry3a基因非芽孢依赖启动子和绿色荧光蛋白基因gfp(Green Fluorescent Protein)的原核表达载体,并转化从桑粒肩天牛幼虫肠道分离的两株常驻细菌短短芽孢杆菌CQUBb和苏云金芽孢杆菌CQUBt,以检测cry3a启动子在昆虫肠道常驻菌中的启动子活性,获得GFP标记菌株,为常驻菌在昆虫幼虫肠道中的定殖情况和杀虫工程菌的构建奠定基础。【方法】采用重叠延伸PCR将cry3a基因启动子和gfp基因进行融合,并与pHT304载体连接构建重组质粒pHT3AG,获得的重组质粒以电脉冲转化肠道常驻菌短短芽孢杆菌CQUBb和苏云金芽孢杆菌CQUBt,于可见光和荧光显微镜下观察荧光并通过SDS-PAGE分析重组菌株的蛋白表达情况,然后对重组菌株进行生长动力学分析和稳定性测试。【结果】重组菌在营养期大量组成型表达GFP,经电泳分离在凝胶上出现约29kDa的特异蛋白条带;重组菌生长曲线与出发菌没有显著差异,说明外源质粒未对宿主菌的生长带来明显不利影响;抗性条件下传代30次后两菌株外源质粒稳定性仍可达95%、67%;两个菌株比较,CQUBb比CQUBt质粒转化率高、重组菌GFP表达时间长、表达量大,并且重组菌株稳定性好。【结论】成功地将cry3a基因核心启动子和gfp基因转入桑粒肩天牛幼虫肠道常驻菌,实现了该启动子在Bt之外的菌株中发挥作用,构建了两个GFP标记菌株;重组基因工程菌株表达量大,稳定性好,可以用作昆虫肠道内微生态研究和芽孢杆菌表达系统以及杀虫菌株的构建。     

饲喂肉杆菌Hg4-03对贡嘎蝠蛾幼虫肠菌生物多样性的影响

【目的】研究贡嘎蝠蛾幼虫肠道优势菌肉杆菌(Carnobacterium sp.)Hg4-03作为食物添加剂对实验室饲养的4龄贡嘎蝠蛾幼虫肠道菌群的影响。【方法】采用16S rDNA序列与PCR/DGGE(Denaturing gradient gel electrophoresis)分析技术相结合的方法,健康幼虫被随机分为处理组1、处理组2和对照组,两组处理组分别饲喂添加不同浓度肉杆菌Hg4-03的天然饲料,对照组只饲喂天然饲料。14 d和28 d后每组随机解剖6条幼虫,收集肠道样品,经细菌通用引物扩增细菌16S rDNA,DGGE分离并进行细菌多样性图谱分析。【结果】饲喂肉杆菌Hg4-03后幼虫肠道菌群的多样性指数呈上升趋势;处理组幼虫肠道中肉杆菌Hg4-03含量增加,且处理组中枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的量也明显增加。【结论】将肉杆菌Hg4-03作为益生菌饲喂贡嘎蝠蛾幼虫有助于维持幼虫肠道菌群多样性平衡,这为贡嘎蝠蛾人工或半人工养殖提供了一定的参考价值。     

贡嘎蝠蛾幼虫肠道真菌多样性分析

[目的]分析贡嘎蝠蛾肠道(Hepialus gonggaensis)幼虫肠道真菌多样性.[方法]采用常规分离与分子鉴定的方法和基于ITS(internal transcribed spacer)基因的RFLP方法,建立贡嘎蝠蛾幼虫肠道真菌的ITS克隆文库,分别用MspⅠ、HaeⅢ和Taq Ⅰ对205个阳性克隆的质粒酶切指纹图谱分析,结果显示有23个不同的RFLP操作分类单元(OTU),对这23个操作分类单元的阳性克隆子进行测序并绘制系统进化树.[结果]结果显示贡嘎蝠蛾幼虫肠道内存在8个属的真菌类群.其中被孢霉属(Mortierella)和丝孢酵母属(Trichosporon)的丰度最高,分别占克隆文库的46.34%和40.00%,鉴定为肠道内的优势真菌类群.用常规分离与分子鉴定方法只获得隐球酵母(Cryptococcus magnus)、Geomyces sp和丝孢酵母(Trichosporon porosum)3个类群的真菌.结合常规分离法与RFLP法能够更有效的分析肠道微生物的多样性,获得更多更全面的微生物多样性信息.