利用细菌表达dsRNA介导黄粉虫抗冻蛋白基因的RNA干扰

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是研究基因功能的一种重要工具。为了利用RNAi技术对黄粉虫抗冻蛋白(Antifreeze protein,AFP)基因的非抗冻功能进行验证,将黄粉虫抗冻蛋白基因Tmafp433的相应干扰片段构建至L4440干扰载体并转化大肠杆菌HT115(DE3)菌株,利用IPTG诱导表达特异的afp基因相应dsRNA,纯化后注射黄粉虫幼虫,通过实时荧光定量PCR检测afp基因在mRNA水平的变化。结果显示含有L4440-Tmafp重组质粒的HT115菌株可以表达干扰afp基因的dsRNA,命名为Tmafp-dsRNA。用Tmafp-dsRNA注射黄粉虫24 h后,Tmafps的表达受到显著抑制,相比对照下降了60.8%。本研究表明通过注射dsRNA可有效抑制黄粉虫afp基因的表达。     

小胸鳖甲胞外铜锌超氧化物歧化酶重组蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

超氧化物歧化酶(SOD)是清除生物体内超氧阴离子自由基的主要抗氧化酶家族。基于原核表达系统,成功表达了拟步甲科Tenebrionidae小胸鳖甲Micordera punctipennis胞外铜锌SOD的重组蛋白(本文定义为Trx-His-MpecCu/Zn-SOD)。经Ni 2+亲和层析法纯化重组蛋白后,研究了重组蛋白的部分酶学性质。通过足垫加皮下注射法3次免疫小鼠后,分别用ELISA和Western blot的方法检测抗体效价和抗体特异性。结果表明,重组蛋白主要以包涵体形式存在,纯化后的重组蛋白浓度为1.33 mg·mL^-1,酶活力为27.52 U·mg^-1。Trx-His-MpecCu/Zn-SOD在25~45℃具有比较稳定的酶活性,在35℃最高,同时表现出比较广泛的酸碱耐受性(pH3~12),最适pH为9.0,表明重组蛋白的酶活性相对比较稳定。蛋白免疫法制备的鼠抗MpecCu/Zn-SOD多克隆抗体滴度高于1∶819 200。Western blot结果显示,该抗体能免疫结合重组蛋白Trx-His-MpecCu/Zn-SOD和小胸鳖甲体内天然MpecCu/Zn-SOD,但不能与黄粉虫Tenebrio molitor的总蛋白结合,说明制备的抗体效价较高且特异性较好。本研究结果为小胸鳖甲ecCu/Zn-SOD功能的深入研究奠定了基础。     

棉铃虫类肌钙蛋白多克隆抗体的制备与鉴定

利用蛋白免疫法制备鼠抗棉铃虫类肌钙蛋白(Helicoverpa armigera Calponin,Ha Cal)的多克隆抗体并进行初步应用。通过原核表达棉铃虫类肌钙蛋白,镍柱纯化获得目的蛋白,经足垫加皮下注射免疫小鼠,4次免疫后用ELISA检测法确定鼠抗Ha Cal蛋白多克隆抗体的效价。通过Western blot和免疫组化检测该多克隆抗体免疫特异性。蛋白免疫法制备的鼠抗Ha Cal多克隆抗体滴度高于1∶819 200。Western-blot和免疫组化显示该抗体能特异性识别棉铃虫体内的天然Ha Cal蛋白。利用蛋白免疫法制备获得了效价高且特异性强的鼠抗棉铃虫Ha Cal多克隆抗体,旨为进一步研究棉铃虫Ha Cal蛋白表达特性及其抗药性功能提供重要的实验工具。     

Effects of High Static Magnetic Fields on Growth and Development of Young Rats

已有报道：强磁埸（ＨＳＭＦ）可改变离体细胞的结构和功能;而未见其对于动物生长发育影响的报道。本研究分别取１０和２０日龄大鼠（雌雄各半）,作１０ＴＨＳＭＦ处理,定期称体重、量体长（Ｔａｂｌｅ１）,取部分器官和组织称重（Ｔａｂｌｅ２）,取静脉血计数红细胞和白细胞（Ｔａｂｌｅ３）。结果表明：与对照组比较,实验组的肾上腺增重１３．２％,白细胞数增加１５．８％,而其它各项数据无显著差异。可能是因为脱离磁埸后,各种调节机大制使机体恢复正常功能,ＨＳＭＦ处理不能对大鼠生长发育产生障碍性影响,但能引起机体产生较强的应激反应。因而有必要从肾上腺皮质激素和髓质激素水平上深入了解其应激程度。由ＨＳＭＦ处理引起白细胞增加的现象与一些临床表现相吻合,可以认为：磁埸处理缩小大鼠乳腺癌肿是由于白细胞数增加提高了机体免疫力的缘故;而白细胞增加过多,又可以是长期接触磁埸的人白血病或其它肿瘤发病率较高的原因。     

昆虫血淋巴的收集技术与方法

血淋巴是昆虫生理生化研究的重要材料之一。文章分析归纳各类昆虫血淋巴的不同收集方法、收集前的昆虫准备以及收集后血淋巴的预处理,并结合该试验室研究阐述在收集昆虫血淋巴过程中的一些问题和经验,为能有效提取血淋巴提供一定的方法支持。     

棉铃虫BR-C Z1基因的克隆及表达谱分析

广泛锌指复合物(BR-C)在棉铃虫Helicoverpa armigera的生长发育过程中有重要作用。基于转录组数据通过PCR克隆获得棉铃虫BR-C Z1(HaBR-C Z1)基因序列,利用生物信息学分析其氨基酸序列,利用qRT-PCR分析基因的表达规律,以及2-十三烷酮(2-TD)处理后基因的表达情况。结果显示,HaBR-C Z1基因的开放阅读框长1 284 bp,编码427个氨基酸,预测编码蛋白的分子量和等电点分别为47.41 kD和7.72。系统进化树显示,HaBR-C Z1与帝王斑蝶Danaus plexippus plexippus的亲缘关系最近。HaBR-C Z1基因在预蛹期和6龄幼虫肠组织中的相对表达量最高。20 mg·g^-1浓度2-TD处理后的相对表达量在6 h达到峰值,为对照组的24.7倍。本研究明确了HaBR-C Z1基因的表达规律及其对2-TD的响应,为深入了解棉铃虫生长发育机制奠定了基础,并为害虫防治提供依据。     

育龄期Ⅰ-Ⅱ期BOT患者PDCD5表达情况及预后分析

目的:探讨与分析育龄期Ⅰ-Ⅱ期卵巢交界性肿瘤(borderline Ovarian Tumor,BOT)患者程序化死亡因子5(programmed cell death 5,PDCD5)表达情况及预后。方法:选取2012年1月到2020年1月在本院诊治的育龄期BOT患者98例作为研究对象,其中临床Ⅰ-Ⅱ期78例(早中期组),Ⅲ期20例(晚期组)。取所有患者的术中病理组织标本,采用免疫组化法检测PDCD5表达情况。跟踪随访患者的预后并进行相关性分析。结果:早中期组的PDCD5表达阳性率为28.2%,显著低于晚期组的80.0%(P<0.05)。两组随访到2020年5月,早中期的存活率为97.4%,显著高于晚期组的65.0%(P<0.05)。在早中期组,Pearson分析显示随访生存与组织学分化、远端转移、PDCD5表达阳性存在相关性(P<0.05)。二元Logistic回归分析显示组织学分化、远端转移、PDCD5表达阳性都为影响患者预后生存的主要因素(P<0.05)。结论:育龄期Ⅰ-Ⅱ期BOT患者伴随有PDCD5的低表达状况,且预后相对比较好,组织学分化、远端转移、PDCD5表达阳性都为影响育龄期Ⅰ-Ⅱ期BOT患者预后生存的主要因素。     

荒漠昆虫小胸鳖甲水通道蛋白基因MpAQP1克隆及低温对其表达的影响

水通道蛋白(aquaporin,AQP)参与细胞的水分平衡与运输,与生物的抗逆性相关,但AQP在昆虫耐寒性中的作用仅有少量报道。为了检测昆虫AQP基因的序列特征及其表达是否与低温相关,本研究从荒漠甲虫小胸鳖甲Microdera punctipennis中克隆获得AQP的开放阅读框(ORF)序列,命名为MpAQP1(Gen Bank登录号:KX129951)。生物信息学分析表明,MpAQP1的ORF长度为813 bp,编码270个氨基酸,分子量为28.59 kDa,理论等电点为7.73。MpAQP1属于萤火虫内嵌蛋白(PRIP)家族,具有6个跨膜结构域和5个螺旋环,含有高度保守的天冬酰胺-脯氨酸-丙氨酸基序(NPA基序)。实时荧光定量PCR检测MpAQP1在低温下的表达谱发现,4℃低温处理1 h,MpAQP1开始上调表达,5 h达到最高峰,为对照组的34.39倍。研究表明MpAQP1为冷响应基因,水通道蛋白可能参与小胸鳖甲低温下的渗透调节而发挥耐寒性功能。     

荒漠昆虫小胸鳖甲抗菌肽Attacin基因的克隆及低温表达模式分析

昆虫在低温冷驯化过程中会发生很多基因表达的改变, 从转录组层面上开展广泛的研究有助于全面认识昆虫对冷响应的分子机制。为了对荒漠昆虫小胸鳖甲Microdera punctipennis的 4℃低温转录组数据中一个上调表达的Attacin基因（MpAttacin1）进行深入了解并分析其对低温诱导的响应情况, 本研究通过生物信息学分析对该基因进行了鉴定, 并利用实时荧光定量PCR对其在低温下的mRNA水平进行了检测。结果表明： 获得的MpAttacin1 cDNA长度为523 bp, 包含一个456 bp的开放阅读框和67 bp的5′端非翻译区。MpAttacin1编码含有151个氨基酸残基的多肽, N端含有17个氨基酸的信号肽序列。同源性分析表明, 其氨基酸序列与其他鳞翅目、 双翅目和鞘翅目昆虫的抗菌肽Attacin具有30%~40%的一致性。以邻接法（neighbor-joining, NJ）构建的系统进化树表明, 小胸鳖甲Attacin1与其他鞘翅目昆虫的Attacin起源于共同的祖先, 属于Attacin_C超家族。实时荧光定量PCR分析结果显示, 在4℃与-4℃低温胁迫时, MpAttacin1基因的转录都呈现先升高后降低的应激反应趋势, 但在对低温的响应时间和强度上有所不同。在4℃处理5 h和9 h后, MpAttacin1的表达量分别为对照组的2.3和3.8倍, 而在-4℃处理7 h和9 h后, 分别为对照组的2.4和1.5倍。这些研究表明, 除已知的抗菌功能外, Attacin在昆虫的低温适应过程中可能也发挥着重要的作用。