新疆棉铃虫赤眼蜂种系筛选——对寄主的选择性

对寄生棉铃虫的暗黑赤眼蜂(Tnchogramma pintoi)和广赤眼蜂(T.eianescens)等2蜂种的6个地理品系(4个采自新疆棉铃虫,2个从乌孜别克斯坦引进)进行了寄主选择性测定.当同时面临棉铃虫卵和米蛾卵时,根据接触卵次数和寄生量等特性,暗黑赤眼蜂乌兹别克Ⅱ品系对棉铃虫卵表现很强的选择性,其次是暗黑赤眼蜂库尔勒品系,其余品系对棉铃虫卵的选择性不明显或对米蛾卵表现强选择性.     

棉铃虫乙醇脱氢酶原核可溶性表达条件的优化北大核心

[目的]提高棉铃虫乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase,ADH)在大肠杆菌中可溶性蛋白的表达量。[方法]研究了诱导温度和诱导剂IPTG浓度对可溶性His-ADH融合蛋白表达量的影响。设置15℃、20℃、25℃、30℃、37℃五个不同温度和0.2 mmol/L、0.4 mmol/L、0.6 mmol/L、0.8 mmol/L、1.0 mmol/L五个不同的IPTG诱导剂浓度分别进行原核诱导表达。基于SDS-PAGE和灰度扫描来评价可溶性融合蛋白的表达水平。[结果]表达的目的融合蛋白相对分子质量约为53 k Da,与预测的分子量大小一致,Western Blot分析表明能与His单克隆抗体特异性结合;可溶性融合蛋白的最佳诱导条件为温度25℃、IPTG浓度0.6 mmol/L。[结论]表达优化最终条件为温度25℃(相对表达量为2.21)、IPTG浓度0.6 mmol/L(相对表达量为1.14)。低温有利于可溶性蛋白的形成,诱导剂IPTG浓度并不是越高越好。     

棉铃虫Ⅳ型几丁质酶的基因克隆、酶学性质及表达谱

【目的】昆虫几丁质酶(chitinase, CHT)主要参与蜕皮、围食膜的降解和机体免疫防御等重要生理生长发育过程。本研究旨在对棉铃虫Helicoverpa armigera Ⅳ型(group)几丁质酶基因进行克隆和表达分析,为以该基因作为棉铃虫防控的分子靶标提供理论依据。【方法】采用RT-PCR和RACE技术从棉铃虫中肠中克隆Ⅳ型几丁质酶基因,分别运用DNAMAN和MEGA软件进行多序列比对和构建系统发育树。在大肠杆菌Escherichia coli(DE3)中诱导表达其体外重组蛋白,利用Western blot进一步验证;用Ni-NTA纯化柱纯化重组蛋白,之后研究该蛋白的酶学性质。qPCR分析该基因的在棉铃虫不同发育阶段和6龄幼虫不同组织中的表达谱。【结果】克隆获得棉铃虫几丁质酶基因HaCHT4(GenBank登录号: MH500771),其cDNA长1 624 bp,ORF长1 527 bp,编码509个氨基酸,预测的分子量为55.2 kD。蛋白质序列的N末端具有信号肽,中间序列部分含有一个催化结构域(catalytic domain, CAD), C末端含有一个几丁质结合结构域(chitin binding domain, CBD)。多序列比对显示,HaCHT4具有几丁质酶的保守区域;系统发育分析表明,HaCHT4属于Ⅳ型几丁质酶。重组蛋白His-HaCHT4在大肠杆菌中成功表达。纯化的重组蛋白对胶体几丁质底物具有降解活性,最适温度和pH分别为50℃和7,动力学参数K_m和V_max值分别为1.76±0.35 mg/mL和0.0220±0.0012 μg/mL·s。qPCR分析表明,HaCHT4在1龄和2龄幼虫期的表达量显著高于其他幼虫龄期及预蛹期;主要在中肠和脂肪体中高度表达,体壁和头部中低表达。【结论】结果提示棉铃虫HaCHT4可能参与围食膜中几丁质降解过程。这些结果为深入研究HaCHT4的功能奠定了基础,并为害虫防治提供了有用的信息。     

荒漠拟步甲科鳖甲族三种幼虫头壳色素区的观察

荒漠拟步甲科鳖甲族昆虫的幼虫具有相似的圆柱状体形,从形态上不易区别。以往对荒漠拟步甲幼虫的形态研究注重于上唇和足等部位的刚毛和小刺的特征,少有对头壳颜色的记载。通过在体视显微镜下观察室内饲养的鳖甲族昆虫(鞘翅目:拟步甲科)小胸鳖甲Microdera punctipennis Kaszab、光滑鳖甲Anatolica polita borealis Kaszab和细颈露颚甲Colposcelis microderoides microderoides Reitter的大龄幼虫,发现它们的头壳色素区呈现出不同的形状和大小,可方便地用于区分这3种幼虫。同时,测量结果显示幼虫头壳宽与前胸背板宽之比在这3种幼虫有显著差异。     

棉铃虫Ⅰ型和Ⅶ型几丁质酶基因表达规律的比较分析

几丁质酶（chitinase, CHT）在昆虫生长发育过程中主要有降解围食膜、外骨骼、角质层以及肠道内层的几丁质成分,从而参与昆虫的蜕皮和细胞增殖的功能。在本研究中,分析比较棉铃虫I型和Ⅶ型几丁质酶HaCHTⅠ、HaCHTⅦ的结构域及其时空表达特性,对的进一步功能研究提供重要的素材。首先利用生物信息学在线工具SMART对本课题组前期所获得的几丁质酶基因HaCHTⅠ、HaCHTⅦ的结构域进行分析;之后采用qRT-PCR方法研究棉铃虫6龄幼虫不同组织和幼虫不同龄期蜕皮前后的中肠中HaCHTⅠ、HaCHTⅦ的时空表达特性。结果表明：对几丁质酶HaCHTⅠ、HaCHTⅦ结构域进行分析,发现HaCHTⅠ和HaCHTⅦ均具有信号肽序列、催化区域、连接区域,且HaCHTⅠ有一个几丁质结合结构域,而HaCHTⅦ则无;棉铃虫Helicoverpa armigera几丁质酶基因HaCHTⅠ和HaCHTⅦ在6龄幼虫不同组织部位的均有表达,其中HaCHTⅠ在各个部位的表达量没有显著的差异,而HaCHTⅦ在头壳和体壁中表达显著高于其它组织;几丁质酶基因HaCHTⅠ、HaCHTⅦ在棉铃虫幼虫蜕皮前后中肠的表达量变化较大,其中HaCHTⅠ在3、4、5、6龄末期及蛹期时的表达量呈递减的趋势,在4、5、6龄初期时表达量则是先减后增的趋势,而HaCHTⅦ在3、4、5、6龄末期及蛹期时的表达量呈递增的趋势,恰与同一时期HaCHTⅠ的表达量相反,在4、5、6龄初期时HaCHTⅦ的表达量呈递减的趋势。棉铃虫HaCHTⅠ和HaCHTⅦ的结构域和时空表达都存在差异,据此我们测这些差异可能对其功能具有一定的影响。本结果为深入研究几丁质酶基因HaCHTⅠ和HaCHTⅦ的功能奠定了基础。     

Flame Seedless葡萄胚珠、胚乳及胚发育与败育的研究

对Flame　Seedless葡萄胚珠、胚乳及胚的发育和败育过程进行了系统的细胞学观察,并以有核葡萄品种北醇为对照对Flame　Seedless的胚珠重量及纵横径进行了测定。结果表明：（1）Flame　Seedless内、外珠被及珠孔发育异常,20％～30％的子房未出现受精现象,受精的胚珠重量和纵横径随着胚珠的发育,先呈增加趋势,在某一时期达到最高值,随后下降,最终退化为痕迹。（2）大约有30％的胚乳核能够进行正常分裂,形成胚乳组织,胚乳在花后30d开始退化,其余胚乳核分裂异常。合子在盛花后第19天进行第一次分裂,经过二细胞原胚→多细胞原胚→球形胍,此后胚开始退化;也有的合子始终不发生分裂,最终退化。（3）由于胚乳分裂异常和提早退化,胚缺乏营养致使其发育中止和败育。（4）Flame　Seedless　胚挽救的最佳接种时期在花后第37天。     

准噶尔小胸鳖甲短时低温胁迫响应的转录组分析

【目的】拟步甲科昆虫小胸鳖甲Microdera punctipennis是分布于中国新疆古尔班通古特沙漠的特有物种,具有很强的耐寒性,但其低温响应的分子机制尚不明确。本研究旨在利用转录组测序技术丰富小胸鳖甲的已知基因信息,分析在短时低温胁迫下,上调表达基因的主要类群及参与的主要代谢通路。【方法】利用Trinity软件对分别在4℃低温和25℃(对照)下处理3 h的小胸鳖甲成虫RNA-Seq数据进行从头组装,利用Blast2go软件进行基因注释。通过DESeq和GFOLD软件分析差异表达基因,并对上调表达基因进行GO(Gene Ontology)和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)代谢途径富集分析。【结果】测序过滤后得到68 165 001个有效读序,51 712个平均长度为984 bp的非冗余基因,其中29 925个基因(约57.87%)有同源序列(E-value10-5),与拟步甲科的赤拟谷盗Tribolium castaneum相应基因相似性最高(核苷酸序列一致性为72.75%)。低温响应上调表达基因有514个,富集到35个GO类群,18个KEGG途径。其中胁迫响应类群、生物调节类群和免疫系统过程类群都占有重要比例,嘌呤代谢、硫胺素代谢、糖酵解/糖异生等代谢通路显著富集。在胁迫响应类群中,热激蛋白Hsp90基因、超氧化物歧化酶(SOD)基因和钙联接蛋白Calnexin基因等8个非生物胁迫相关基因显著上调表达。【结论】荒漠昆虫小胸鳖甲低温转录组揭示,在4℃冷驯化过程中,代谢过程、胁迫响应、生物调节和免疫系统等生物学过程相关基因表达显著上调,其中几个非生物胁迫响应基因提示小胸鳖甲可能从分子伴侣、细胞周期阻滞、线粒体稳定性、抗氧化胁迫等多方面应对低温胁迫。KEGG富集分析所揭示的小胸鳖甲在低温下的转录组代谢通路与其他物种有较大差异。研究结果为后续生物信息学分析及小胸鳖甲耐寒关键基因的发掘及耐寒机制的揭示提供了基础数据。     

假单性结实无核葡萄胚败育机理研究

以Flame Seedless、大粒红无核和京可晶3个假单性结实无核葡萄品种为试材,对其胚和胚乳的发育进行了细胞学观察,并初步探索了胚败育机理.结果表明:Flame Seedless、大粒红无核和京可晶3个无核葡萄品种胚乳开始败育的时期分别为花后29、42、34 d,胚开始大量败育的时期分别为花后39、51、45 d;假单性结实无核葡萄胚的败育是由于胚乳败育、胚缺乏营养所致.     

棉铃虫BR-C Z1基因的克隆及表达谱分析

广泛锌指复合物(BR-C)在棉铃虫Helicoverpa armigera的生长发育过程中有重要作用。基于转录组数据通过PCR克隆获得棉铃虫BR-C Z1(HaBR-C Z1)基因序列,利用生物信息学分析其氨基酸序列,利用qRT-PCR分析基因的表达规律,以及2-十三烷酮(2-TD)处理后基因的表达情况。结果显示,HaBR-C Z1基因的开放阅读框长1 284 bp,编码427个氨基酸,预测编码蛋白的分子量和等电点分别为47.41 kD和7.72。系统进化树显示,HaBR-C Z1与帝王斑蝶Danaus plexippus plexippus的亲缘关系最近。HaBR-C Z1基因在预蛹期和6龄幼虫肠组织中的相对表达量最高。20 mg·g^-1浓度2-TD处理后的相对表达量在6 h达到峰值,为对照组的24.7倍。本研究明确了HaBR-C Z1基因的表达规律及其对2-TD的响应,为深入了解棉铃虫生长发育机制奠定了基础,并为害虫防治提供依据。     

棉铃虫(Helicoverpa armigera)FK506结合蛋白基因的克隆、表达与纯化

为了深入了解FK506结合蛋白基因的作用和探索调控棉铃虫CYP6B6的表达机制,基于单酵母杂杂交结果采用RT-PCR的方法从棉铃虫的中肠cDNA中扩增得到了FK506结合蛋白基因,将测序正确的目的片段克隆至原核表达载体pET32a中,在大肠杆菌BL21中用异丙基-β-D-硫代半乳糖(IPTG)诱导表达,通过镍柱离子亲和层析纯化目的蛋白。用SDS-PAGE检测目的蛋白的表达和纯化结果,并用Western blotting进行验证。结果表明,克隆得到的目的基因大小为327 bp,编码108个氨基酸残基,预测蛋白质分子量和等电点分别是11.78 kD和7.87。氨基酸序列分析表明该序列具有完整的开放阅读框,且没有信号肽。重组质粒pET32a-FKBP在大肠杆菌BL21中获得表达,主要以可溶性形式存在,经亲和层析柱纯化获得目的蛋白,Western blotting检测发现纯化的目的蛋白大小正确且纯度高。