猪FSH β亚基基因结构区Alu序列插入突变的研究

通过聚合酶链式反应（PCR）对中国华北型优良地方猪种莱芜猪及杜里猪,长白猪的卵泡刺激素（FSH）β亚基基因结构区插入片段进行扩增,并对0．5kb扩增产物进行克隆和测序,序列分析表明,在已发表的猪FSHβ亚基基因全序列的＋809和＋810碱基之间,莱芜猪,杜里猪和长白猪分别存在一个长度为275,277和274bp的插入片段,插入片段末端的poly(A)分别为17,19和16个腺苷酸,均显著短于高产猪种太湖猪（292bp和32个腺苷酸）,对FSHβ亚基基因插入片段进行BamHI多态性分析,发现本研究所检测样品中不存在BamHI 多态性,插入片段中存在一个RNA聚合酶Ⅲ启动子及AluI内切酶识别位点,所以该睡段可能为Alu成分,因RNA聚合酶Ⅲ这种有功能的内部启动子能够转录相邻的染色体序列,该插入片段可能影响FSHβ亚基基因或其他基因的表达调控,把FSHβ亚基基因作为控制猪产仔数主效基因的候选基因与产仔数进行连锁分析,证明FSHβ基因因座在莱芜猪种中与控制猪产仔数的主效基因紧密连锁,优质基因AA纯合子比BB纯合子母猪平均每胎产仔1．2头,因不同品种猪插入序列的主要差异是末端的poly(A)长短不同,推测该插入片段末端的pol(A)结构亦可能影响猪的产仔数。     

工程菌酯酶B1的纯化及性质研究

工程菌酯酶B1降解酶经硫酸铵分级沉淀、DEAE SepharoseCL 6B离子交换柱层析、SephadexG 1 5 0凝胶过滤 ,得到了分离纯化 ,SDS PAGE鉴定为单一组分。经 1 2 .5 %SDS PAGE法测得分子量约为 5 6KD ,提纯倍数为33.3,收率为 1 7.9%,比活力为 74 .7U/mg。该酶的最佳作用条件是 37℃ ,pH =7.0 ,该酶作用于α 乙酸萘酯的Km为1 .35× 1 0 -3 mM ,Vmax为 2 .7× 1 0 4μ/ml。酶在pH6～ 9范围内较稳定 ,重金属Cu2 对该酶具有明显的促进作用 ,而SDS对酶具有抑制作用 ,对有机磷农药对硫磷 (1 6 0 5 )的降解率在 90min内达 91 .5 %。     

混合菌群YC-BJ1对有机磷阻燃剂的降解及16S rRNA基因多样性分析

作为阻燃剂,有机磷酸酯广泛应用于工业制品和人类生活用品中,是一种全球性的环境污染物,因其具有特殊的理化性质,自然条件下很难水解。因此,对有机磷酸酯的微生物降解成了当下的研究热点。通过持续逐级富集,从北京某垃圾处理厂渗透液中富集到一个混合菌群(编号为YC-BJ1),并在降解特性、底物谱以及物种组成多样性3个方面对其进行定性鉴定。该菌群能够高效降解磷酸三苯酯(Triphenyl phosphate, TPhP)和磷酸三甲苯酯(Tricresyl phosphate, TCrP),培养4 d能够实现对100 mg/L TPhP和TCrP的基本降解,降解率分别为99.8%和91.9%。降解特性研究发现,该混合菌群具有出色的环境适应能力,能够在较宽的环境条件下(温度15–40℃,pH 5.0–12.0, 0%–4%盐)保持对TPhP的降解能力。底物谱分析发现,混合菌群YC-BJ1能够降解部分含氯有机磷阻燃剂,培养4d,对磷酸三(1,3-二氯异丙基)酯(Tris(1,3-dichloroisopropyl)phosphate,TDCPP)和磷酸三(2-氯乙基)酯(Tris(2-chloroethyl) phosphate, TCEP)的降解率分别为16.5%和22.0%。16S rRNA基因物种多样性分析发现,混合菌群YC-BJ1中物种丰度最高的3个菌属分别是生丝微菌属Hyphomicrobium (38.80%)、金黄杆菌属Chryseobacterium (17.57%)和鞘氨醇盒菌属Sphingopyxis (17.46%)。与目前已报道的有机磷阻燃剂降解菌和菌群相比,混合菌群在降解效率和环境适应能力方面都具有极大的优势,有较广泛的应用空间。高效降解菌群的富集能够为有机磷阻燃剂的降解及其环境污染生物修复提供微生物资源,并为其降解机理的探索提供支持。     

MehpH的生化与结构特性（英文）

【目的】本研究旨在系统探究环境因素对邻苯二甲酸单乙基己基酯水解酶(monoethylhexyl phthalate hydrolase,MehpH)活性的影响,模拟该酶的3D结构并分析活性中心氨基酸残基与底物之间的相互作用。【方法】根据标准的酶学实验验证了环境因素对酶活性的影响。该酶的基本结构分析由DNAMAN(2.1)分析所得,同时利用SWISS-MODEL对其3D模型进行预测,并通过PyMOL软件对相关结果作了可视化处理。Autodock工具,Swiss-Pdb以及Py MOL均用以酶与邻苯二甲酸单乙基己基酯(monoethylhexyl phthalate,MEHP)的相互作用分析。【结果】该酶的初级结构与已报道Gordonia sp.P8219菌株中的酯类水解酶相似,该酶的最适温度与p H(分别为40°C和8.0)和菌株P8219有所不同;该酶在有机溶剂、洗涤剂和金属离子环境中表现出良好的稳定性;然而,其酶活受2 mol/L的Ni~(2+)、Fe~(3+)、Cu~(2+)和Zn~(2+)离子,1 mol/L苯甲基磺酰氟(PMSF),0.5 mol/L的对氧磷,1 mol/L苯基醚(PGO),2 mol/L焦碳酸二乙酯(DEPC)和5 mol/L的毒扁豆碱所抑制。丝氨酸水解酶中高度保守五肽基序GXSXG与催化三联体HSD结构均存在于该酶的编码序列中。根据分子对接结果,Thr152与Ser230在水解酶与其模板之间也显得更为保守,且与MEHP联系较为紧密(分别为5.8?和3.6?),可能起着重要的催化作用。而MEHP与催化氨基酸残基Ser125、His291、Asp259并不十分靠近。【结论】YC-RL2中MehpH在有机溶剂、洗涤剂以及金属离子环境中具有稳定的生物活性,表明其具有良好的应用潜力。酶的结构及活性中心得到了初步的分析,对于催化机理及酶改造研究具有重要意义。     

鱼类低温耐受机制与功能基因研究进展

不同鱼类适应环境温度的能力不同,这是经过长期适应和进化的结果,是遗传信息特异性表达的具化表现,也是鱼类自身生理生化性能差异的反映。当前,对低温下鱼类的生理反应已经有深入研究,同时,对鱼类适应低温环境和耐受低温胁迫的分子生物学机制的研究方兴未艾,引起研究人员的广泛兴趣。高通量测序技术成本的降低和生物信息学技术的应用,允许研究者利用组学方法研究低温胁迫下鱼类的代谢途径和分子信号通路,在生物整体水平上分析鱼类响应低温胁迫的分子机制,挖掘低温耐受功能基因。研究发现,极地鱼类在长期适应环境的过程中,基因组不断进化,通过功能基因的获得、缺失和大规模扩增,适应长期低温环境;在转录调控水平上,低温胁迫下鱼类转录表达谱既表现出多细胞动物的保守性,同时又具有明显的物种特异性和组织特异性。抗冻(糖)蛋白、分子伴侣、代谢酶类和膜通道蛋白等都参与鱼类响应低温胁迫的过程。但是,不同种类蛋白质的编码基因结构与表达、功能与应用研究不尽相同。从进化、遗传表达和表观遗传学角度分别综述鱼类低温耐受的分子机制,总结鱼类低温耐受相关功能基因,预测鱼类低温耐受机制和应用研究热点,旨在为本领域研究人员提供思路。     

解毒酶基因的克隆及其在大肠杆菌和蓝藻中的表达(英文)

近几年来 ,在明确了杀虫药剂抗性机理的基础上 ,从杀虫药剂抗性的昆虫中分离出高抗性基因 (即解毒酶基因 ) ,将该基因克隆到表达载体 pRL 4 39上 ,得到表达载体 pRL B1,将其转化大肠杆菌HB10 1,获得了可以表达解毒酶基因的转基因工程菌株。同时构建了穿梭表达载体 pDC B1,并转化大肠杆菌HB10 1后 ,在抗生素氨卞霉素 (30 μg/mL)和卡那霉素 (30 μg/mL)平板上挑选阳性克隆 ,将阳性克隆的细胞、蓝藻和结合质粒以三亲结合转移的方式转入蓝藻。斑点杂交、Southern分析结果表明已经获得了Synechococcussp .PCC 794 2转基因工程藻。     

解毒酶基因在蓝藻中的克隆与表达

用抗性库蚊酯酶基因B1的cDNA片段插入质粒pRL-439中的强启动子之后,再与穿梭表达载体pDC-8相连构建成大肠杆菌蓝藻穿梭表达载体pDC-B1,然后通过三亲接合转移法将pDC-B1转入蓝藻Synechococcus sp. PCC7942中,经新霉素筛选获遗传稳定的转基因藻株;纯化单藻落在液体中扩大培养,提取蓝藻质粒,Southern杂交确证B1cDNA已转入受体细胞;用酯酶的特异性底物β-乙酸萘酯(β-NA)检测B1的表达,转基因藻对β-NA的降解明显高于野生藻,证明酯酶B1基因在转基因藻中得到表达。     

魔斑合成酶的分离、鉴定及功能分析

细菌响应营养饥饿或环境胁迫的反应称为严谨反应.本文采用Native-PAGE技术从毒死蜱胁迫下的Klebsiella sp.CPK菌株全细胞蛋白中分离得到了1种特异蛋白,该蛋白通过TOF-MS测序推测为魔斑合成酶RelA.对该蛋白编码基因进行PCR扩增,并利用ORF Finder,showorf等生物信息学软件对其开放性阅读框架进行鉴定,获得了1个全长为2 238bp的完整relA基因.序列及系统发育分析表明,Klebsiella sp. CPK菌株的RelA蛋白与E.coli RelA蛋白的同源性为92%,但与双功能的Rel-SpoT蛋白同源性却比较低.由此推测,Klebsiella sp. CPK RelA蛋白可能只有魔斑合成酶活性.另外,对relA基因进行功能互补分析表明,该基因编码的特异蛋白具有魔斑合成酶活性,从而证明了Klebsiella sp. CPK菌株在毒死蜱胁迫下能够产生典型的严谨反应。     

CP1菌株的分离、筛选及其对毒死蜱的降解

从生产毒死蜱的农药生产厂曝气池中分离、筛选到降解毒死蜱且能以毒死蜱为唯一碳源生长的微生物菌株,命名为CP1。根据该菌株的Biolog特性鉴定和16S rRNA序列相似性分析,初步鉴定该菌为苍白杆菌属(Ochrobactrum sp.)。利用正交实验和Box-Behnken响应面法对影响CP1菌株降解毒死蜱的主要因素进行优化分析,得到菌株CP1对毒死蜱的最适降解条件为:农药浓度100 mg/L,pH值7.0,温度为28.5°C。优化后,CP1对毒死蜱的降解率由最初的70.26%提高到75.18%。毒死蜱降解优化试验提高了CP1菌株对毒死蜱的生物降解性能。     

杀菌剂苯并异噻唑啉酮对斑马鱼胚胎的急性毒性和氧化应激效应研究

苯并异噻唑啉酮(Benzisothiazolin,BIT)是一种广泛使用的工业防腐剂,在水体中分布较广,对水生生物特别是对鱼类存在潜在威胁。本研究以斑马鱼为受试生物,通过96 h急性暴露实验,氧化应激效应检测和相关基因表达量的分析,研究BIT对斑马鱼胚胎的发育毒性和氧化损伤。结果表明BIT对受精后51 h(51 hours post-fertilization,51 hpf)斑马鱼胚胎孵化具有强烈抑制作用,能导致胚胎畸形,96 h半致死浓度(96 h half lethal concentration,96h-LC50)为3.65 mg/L,96 h半数致畸浓度(96 h half teratogenic concentration,96 h-TC50)为1.31 mg/L。氧化应激相关酶(SOD,CAT,GST)的活性都受到了不同程度的影响,抗氧化相关基因(Mn-sod,cat,gstp-2,nqo-1,cox-1和ucp-2)的表达量也受到了干扰,这些结果说明机体受到了严重的氧化损伤。细胞凋亡相关基因(bcl-2和bax)的表达模式也向着促进凋亡的方向发生改变,表明氧化损伤导致了细胞凋亡。BIT对斑马鱼胚胎具有很高的发育毒性,能造成机体氧化损伤,最终导致胚胎死亡。本实验结果可为BIT在环境中的风险管理提供科学依据。