MehpH的生化与结构特性

[目的]本研究旨在系统探究环境因素对邻苯二甲酸单乙基己基酯水解酶（monoethylhexyl phthalate hydrolase,MehpH）活性的影响,模拟该酶的3D结构并分析活性中心氨基酸残基与底物之间的相互作用。[方法]根据标准的酶学实验验证了环境因素对酶活性的影响。该酶的基本结构分析由DNAMAN （2.1）分析所得,同时利用SWISS-MODEL对其3D模型进行预测,并通过PyMOL软件对相关结果作了可视化处理。Autodock工具,Swiss-Pdb以及PyMOL均用以酶与邻苯二甲酸单乙基己基酯（monoethylhexyl phthalate,MEHP）的相互作用分析。[结果]该酶的初级结构与已报道Gordonia sp. P8219菌株中的酯类水解酶相似,该酶的最适温度与pH （分别为40℃和8.0）和菌株P8219有所不同;该酶在有机溶剂、洗涤剂和金属离子环境中表现出良好的稳定性;然而,其酶活受2 mol/L的Ni²⁺、Fe³⁺、Cu²⁺和Zn²⁺离子,1 mol/L苯甲基磺酰氟（PMSF）,0.5 mol/L的对氧磷,1 mol/L苯基醚（PGO）,2 mol/L焦碳酸二乙酯（DEPC）和5 mol/L的毒扁豆碱所抑制。丝氨酸水解酶中高度保守五肽基序GXSXG与催化三联体HSD结构均存在于该酶的编码序列中。根据分子对接结果,Thr152与Ser230在水解酶与其模板之间也显得更为保守,且与MEHP联系较为紧密（分别为5.8 Å和3.6 Å）,可能起着重要的催化作用。而MEHP与催化氨基酸残基Ser125、His291、Asp259并不十分靠近。[结论]YC-RL2中MehpH在有机溶剂、洗涤剂以及金属离子环境中具有稳定的生物活性,表明其具有良好的应用潜力。酶的结构及活性中心得到了初步的分析,对于催化机理及酶改造研究具有重要意义。     

一种pH和热稳定的联苯水解酶的纯化及其特征

【目的】通过联苯水解酶的表达,纯化,化学修饰以及酶学性质研究,以期了解水解酶的结构和功能,为其定向改造,获得高效的和能够拓宽底物范围的新突变酶奠定基础。【方法】将水解酶基因在大肠杆菌BL21(Escherichia coli BL21)中进行异源表达,表达产物经离子交换层析以及凝胶层析后进行酶学特性研究,同时通过圆二色谱法对该酶二级结构与热稳定性之间的关系进行分析。【结果】经Q Sepharose和Sephacryl S-300两步纯化获得了电泳纯的联苯水解酶(biphenyl hydrolase,BphD),SDS-PAGE鉴定其单体为31 kDa,Sepharose 12凝胶柱层析分析其为四聚体。该酶最适反应温度和最适pH分别为80℃和9,在pH4-11的缓冲液中酶活相对稳定。该酶在60℃温浴1 h,酶活剩余90%,而在70℃温浴时,半衰期为1 h,是迄今为止在红球菌中报道的唯一一例热稳定性高的水解酶。圆二色谱显示该酶以α-helix占主导地位,当温度升高到70℃时,其二级结构发生了明显的变化,75℃和80℃时BphD的结构已经遭到严重的破坏。序列比对表明:Ser,His,Asp以及Trp残基在几种同源水解酶中相对保守。化学修饰表明Ser,His,Asp在R04水解酶催化底物水解过程中担任重要角色,Trp残基可能位于酶的活性中心,并作为关键氨基酸参与底物的水解过程。【结论】获得了电泳纯的BphD,其pH稳定性以及耐高温特性在同源水解酶中较为罕见,色氨酸关键氨基酸的地位也为进一步了解该酶转化底物的机制奠定了一定的基础。     

嗜热丁烷氧化古菌Candidatus Syntrophoarchaeum烷基转移酶MtaA催化丁基辅酶M的分子机制研究

【背景】嗜热古菌Candidatus Syntrophoarchaeum可以与硫酸盐还原细菌共生,通过逆转产甲烷途径进行正丁烷的氧化,但在该过程中负责催化丁基辅酶M氧化的酶尚未确定。【目的】利用分子动力学模拟证明Ca.Syntrophoarchaeum中mta A基因编码的蛋白可以特异性催化丁基辅酶M中丁基的转移,并非转移甲基。【方法】使用Methanosarcina mazei辅酶M甲基转移酶Mta A的晶体结构(PDB ID:4ay8)作为模板,对Mta A_1 (Gen Bank登录号OFV65993.1)和Mta A_2 (Gen Bank登录号OFV65678.1)进行同源建模。使用分子对接得到两者分别结合CH_3-Co M和C_4H_9-Co M时的结构,并用AMBER18进行分子动力学模拟。【结果】当Mta A_1和Mta A_2分别结合C_4H_9-Co M时,表现出与4ay8晶体结构类似的TIM-Barrel折叠三维结构,但在活性中心形状、Zn~(2+)与底物距离以及活性位点附近氨基酸配位方式等方面存在差异,这可能是导致Ca.Syntrophoarchaeum中mta A基因编码的蛋白催化丁基辅酶M氧化的原因。其中Mta A_2与4ay8结构更相似,活性中心氨基酸配位更完整,暗示其更可能具备催化活性。然而当Mta A_1和Mta A_2分别结合CH_3-Co M时,整体结构不合实际,活性中心Zn~(2+)与底物距离过远,表明底物几乎不可能与酶结合。【结论】Ca.Syntrophoarchaeum中的Mta A_1和Mta A_2很可能是特异性的丁基转移酶,而非催化甲基的转移,其中Mta A_2具备活性的可能性更高。     

猪肝DFPase的结构及某些性质的研究

 本文对纯化了的猪肝DFPase~[**]进行了一系列结构和性质的测定。用重复中毒的方法证明了猪肝中低分子量二异丙基氟磷酸酯(DFP)水解酶(DFPase)是属于催化酶。分析了DFPase的氨基酸组成并求出其分子量为17900。该酶的km值为6.7×10~(-4)mol/L。催化水解DFP的最适pH为7.5～7.7,反应最佳温度为70℃。根据催化水解DFP、Soman的活力以及Mn~(2+)对此酶的影响证明该酶属于Mazur type DFPase~[1]。     

意大利蜜蜂N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的分离纯化及性质分析

【目标】N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖糖苷酶(NAGase)是一种重要的几丁质分解酶,能从N-乙酰葡萄糖苷的非还原端催化去除β-1,4-N-乙酰-D-氨基葡萄糖残基,参与了昆虫外骨骼的蜕皮过程。研究蜜蜂该酶的特征有助于阐明其在蜜蜂发育过程中的作用机制。【方法】采用40%-70%硫酸铵分级沉淀、DEAE-纤维素离子交换层析和葡聚糖G-100凝胶过滤层析的方法从意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica幼虫体内分离纯化NAGase。以对-硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷(pNP-NAG)为底物检测该酶的活力,用native PAGE和SDS-PAGE检测酶的纯度。IEF-PAGE测定该酶等电点。葡聚糖G-200凝胶过滤层析测定酶的总分子量。【结果】结果显示,纯化的NAGase酶的比活力为803. 09 U/mg,总分子量为77. 3 kD。结合SDS-PAGE表明该酶由两个具有相同分子量(39 k D)的亚基组成。该酶等电点为4. 8。酶水解底物pNP-NAG的过程遵循米氏方程,米氏常数(Km)和最大反应速度(Vm)分别为0. 11 mmol/L和17. 65μmol/L·min。该酶水解反应的最适pH和最适温度分别为pH 5. 5和60℃。酶催化pNP-NAG反应的活化能为64. 8 k J/mol。Pb2+,Cu2+,Zn2+和Al3+对该酶有不同程度的抑制作用。【结论】本研究描述了意大利蜜蜂NAGase的分离纯化方法及其理化性质,为进一步进行蜜蜂NAGase的结构解析和功能研究奠定基础。     

红纹黄单胞菌α-氨基酸酯水解酶的分离纯化及酶学性质

【目的】从红纹黄单胞菌中分离纯化了胞内α-氨基酸酯水解酶(AEH),并进行了酶学性质研究。【方法】采用乙酸丁酯破碎细胞,并相继用磷酸钙凝胶沉淀、硫酸铵分级沉淀、DEAE Sephadex A-50阴离子交换处理、CM Cellulose 52离子交换层析和Sephadex G-200凝胶过滤层析纯化得到了电泳纯α-氨基酸酯水解酶,并研究了此酶的酶学性质。【结果】SDS-PAGE显示α-氨基酸酯水解酶的亚基分子量为70 kDa。酶促合成头孢克洛的最适pH为6.8,最适温度为42℃,在pH5.0-8.0和35℃以下,酶保持了良好的稳定性。Mn2+和Ca2+对酶活有一定的促进作用,Cu2+、Fe2+及高浓度的丙酮对酶活有强的抑制作用。AEH催化D-苯甘氨酸甲酯、D-对羟基苯甘氨酸甲酯和头孢克洛水解反应的kcat/Km分别为123.7±3.7 mmol-1.s-1.L、2.9±0.6 mmol-1.s-1.L和101.3±2.1 mmol-1.s-1.L,AEH对D-苯甘氨酸甲酯的催化效率最高。AEH催化双底物反应的机制为乒乓机制,催化合成头孢克洛的kcat为547.3±38.2 s-1。【结论】有关红纹黄单胞菌α-氨基酸酯水解酶的酶学性质研究相对较少,本文的研究将为该酶催化合成β-内酰胺类抗生素的工业化应用提供重要参数。     

酿脓链球菌Cas9核酸酶的重组表达、分离纯化及酶学特性

【背景】Cas9核酸酶是一种RNA引导的核酸内切酶,可与单链向导RNA (single-guide RNA,sgRNA)形成稳定的核糖核蛋白复合物,识别和切割特定的核苷酸片段。由于其具备高灵活性和高效率的特点,目前已经成为基础科学研究领域和临床治疗方法中使用最广泛的基因编辑工具。【目的】为Cas9核酸酶的合理开发和利用提供理论依据。【方法】利用大肠杆菌表达系统表达野生型酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes) Cas9核酸酶,经硫酸铵沉淀和镍柱亲和层析两步纯化获得较高纯度表达产物,并对其热稳定性、pH稳定性、金属离子的影响等酶学特性进行研究。【结果】经高密度发酵后,大肠杆菌湿菌重达191.0 g/L。纯化后酿脓链球菌Cas9核酸酶的比酶活达641.29 U/mg,纯化倍数为16.02,收率为46.40%。Cas9核酸酶在25-42°C保温2 h后剩余酶活保持在65%以上,而在45°C保温15 min后全部失活;其在pH 6.0-10.0范围内稳定性较高,剩余酶活大于68%,在pH9.0时稳定性最高;0.5-20.0mmol/L浓度范围内的Mg~(2+)对该酶有激活作用,10.0 mmol/L的Mg~(2+)可使该酶酶活力提高约23%;Ba~(2+)、Co~(2+)、Ca~(2+)、Mn~(2+)、Cu~(2+)、Fe~(2+)、Zn~(2+)对该酶有不同程度的抑制作用,其中0.5 mmol/L的Cu~(2+)和Fe~(2+)对Cas9核酸酶有完全抑制作用。【结论】异源表达并纯化出具有较高纯度和较高酶活力的酿脓链球菌Cas9核酸酶,并对其酶学特性进行了初步研究,该结果对CRISPR/Cas9技术的进一步推广和应用有一定的指导意义。     

定点突变对酰胺水解酶DamH可溶性表达和酶活的影响

摘要:【目的】DamH是一种具有酯酶活性的酰胺水解酶,其非活性中心氨基酸残基的突变对重组酶可溶性表达和比酶活产生一定的影响。拟探索DamH的活性中心氨基酸残基构成,并对其非活性中心氨基酸残基突变对可溶性表达和比酶活的影响进行研究。【方法】通过重叠延伸的方法对DamH可能的活性中心氨基酸S149、E244和H274以及非活性中心氨基酸D165及N192进行定点突变,通过静息细胞测活验证了S149、E244和H274 在催化2-氯-N-(2’-甲基-6’-乙基苯基)乙酰胺(CMEPA)水解反应中的作用,通过Ni2+- NTA亲和层析对D165及N192突变子进行纯化,对突变株和野生型比酶活进行比较。【结果】研究表明S149A使DamH的CMEPA 水解酶活性下降为野生型的5%,E244A和H274A突变导致其失去活性;D165P和N192P突变影响到DamH的可溶性表达,表达量分别为野生型的28.2%和20.8%,突变子N192P、D165P比酶活分别为野生型比酶活的55.5%和49.7%。【结论】DamH催化酯类底物和芳基酰胺类底物可能共用同一活性中心S149、E244和H274,其两个α螺旋的转角处氨基酸侧链极性和刚性结构的改变对可溶性表达以及活性有很大的影响。     

几丁质酶基因的克隆表达及酶学性质

【背景】几丁质是自然界中储藏量仅次于纤维素的有机物,几丁质酶能降解几丁质生成几丁寡糖,实现废弃物的高值化利用,目前菌株产几丁质酶能力低限制了它的生产应用。【目的】克隆弧菌(Vibrio sp.)GR52的几丁质酶基因,实现其在大肠杆菌中的异源表达,对分离纯化的重组几丁质酶进行酶学性质研究。【方法】以弧菌GR52菌株基因组DNA为模板,克隆得到几丁质酶基因GR52-1,构建重组基因工程菌BL21(DE3)/p ET22b-chi GR52-1,诱导表达的产物通过Ni-NTA树脂纯化后进行酶学性质研究。【结果】重组酶的最适反应pH为6.0,在pH5.0-10.0范围内37°C保温1 h仍能保持85%以上的相对酶活力,具有较好的pH稳定性;最适反应温度为50°C,在45°C保温1 h其酶活力基本没有损失,在50°C保温1 h其残余酶活力仍达60%;在1 mmol/L浓度下,Cu~(2+)、Ca2+对该酶具有促进作用,Hg+对该酶具有明显的抑制作用;在5 mmol/L浓度下,Ni+对该酶具有一定的促进作用,Mn~(2+)、Co~(2+)、Li~+、Fe~(2+)、Hg~+、SDS(十二烷基硫酸钠)对该酶具有明显的抑制作用。以胶体几丁质为底物时,动力学参数Km、Vmax、kcat分别为0.85 mg/m L、0.19μmol/(m L·min)和7.02 s-1。底物特异性分析表明该重组酶能特异性降解几丁质。【结论】重组几丁质酶具有良好的酶学性质,为几丁质酶的开发应用奠定基础。     

Pseudomonas putida KT2440低特异性L-苏氨酸醛缩酶的表达、酶学性质及温度稳定性提高

【目的】从Pseudomonas putida KT2440基因组中,钓取低特异性L-苏氨酸醛缩酶基因(lta E),构建重组大肠杆菌。研究目标酶的酶学性质,和关键氨基酸位点突变对酶活和温度稳定性的影响。【方法】以P. putida KT2440基因组DNA为模板,PCR扩增出lta E基因,构建重组表达质粒p ET28a-KT2440并转化Escherichia coli BL21 (DE3),获得重组菌E. coli BL21 (DE3)/p ET-KT2440,利用Ni~(2+)柱亲和层析纯化低特异性L-苏氨酸醛缩酶(LTA),对关键氨基酸位点Thr206和Lys207实施定点突变。【结果】SDS-PAGE结果表明LTA在大肠杆菌中获得高效表达,分子量为40k Da左右,与理论值大小相符。Ni~(2+)柱亲和层析纯化LTA,获得单一条带。利用双酶耦联法测得LTA酶活为5577.3U/mg,最适反应温度为50°C,最适p H为8.0。在温度低于45°C,p H 5.0-9.0时,重组酶较稳定。LTA酶的Km和kcat值为23.95 mmol/L和19216.6 s–1。Mg~(2+)、Ca~(2+)金属离子对LTA有明显的促进作用,而Ni~(~(2+))、Cu~(2+)、Zn~(2+)、Fe~(2+)等对酶有明显的抑制作用。该酶在叔丁基甲基醚溶剂中具有良好的耐受性,在叔丁基甲基醚中保存1h后仍保留90%以上的酶活。Thr206Ser突变明显提高了酶对温度的稳定性。Lys207对酶催化功能是必需的,该位点突变对酶活都是致死的。【结论】克隆并表达P. putida KT2440的LTA酶,研究了酶学性质,通过定点改造提高了酶的温度稳定性,筛选获得一种酶耐受性好的有机溶剂,为LTA酶在有机溶剂中高效稳定催化β-羟基-α-氨基酸奠定了较坚实的研究基础。     

棉铃虫可溶型海藻糖酶的化学修饰

【目的】本研究旨在通过分析化学修饰剂对棉铃虫Helicoverpa armigera可溶型海藻糖酶活性的影响,以明确海藻糖酶活性中心的结构特点和氨基酸构成。【方法】采用化学修饰方法,测定不同修饰剂处理后棉铃虫5龄幼虫海藻糖酶催化活性的变化,进而通过化学修饰反应失活常数来推测酶活性中心的特定氨基酸残基数量。【结果】采用8 mmol/L水溶性碳二亚胺(carbodiimide,EDC)溶液和25 mmol/L苯甲酰甲醛(phenylglyoxal,PG)溶液分别对棉铃虫5龄幼虫海藻糖酶羧酸基团和精氨酸残基进行修饰后,其活性分别减少81.58%和54.14%,这表明对羧酸基团和精氨酸残基的修饰可有效抑制海藻糖酶活性。底物海藻糖可保护海藻糖酶不受修饰剂的影响。修饰动力学结果显示,海藻糖酶活性中心可能包含1个羧酸基团和2个精氨酸残基。【结论】结果表明,含有羧基的谷氨酸和天冬氨酸是海藻糖酶活性中心的催化残基,精氨酸是维持海藻糖酶活性的必要残基。本研究结果可为开发新型农药提供理论支持。     

来源于海洋细菌Altererythrobacter luteolus SW109T的新型酯酶E29的克隆表达及其酶学性质

【目的】克隆表达一个来源于海洋细菌的酯酶E29,并研究其酶学性质。【方法】从细菌Altererythrobacter luteolus SW109T中筛选并扩增出一个酯酶基因,将其克隆至p SMT3载体上,并将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)中进行异源表达,分析表达产物的酶学性质。【结果】氨基酸序列分析结果表明,酯酶E29属于脂类水解酶第二家族(Family II)。酶学性质分析结果显示,酯酶E29的最适反应底物为对硝基苯酚丁酸酯,最适反应温度为45°C,最适反应pH为8.5;10 mmol/L的Co~(2+)和Mn~(2+)及15%的异丙醇和乙腈能强烈抑制酯酶E29的活性,1%的SDS能使酶失活,甘油的存在能促进酶活性。【结论】酯酶E29是一个海洋来源的新型酯酶,其具有较高的酶活力值、较宽的底物谱以及对部分有机溶剂和金属离子较好的耐受性,在工业方面具有潜在的应用价值。     

嗜冷嗜酸β-1,4-木聚糖酶及其钙离子依赖型碳水化合物结合模块

【目的】β-1,4-木聚糖酶是木聚糖降解的关键酶之一,嗜冷嗜酸木聚糖酶在功能性低聚木糖的制备中具有重要作用,但相关报道较少。【方法】从太平洋火色杆菌(Flammeovirga pacifica)菌株WPAGA1基因组发掘到一条新型的木聚糖酶序列,经基因合成、质粒构建和表达,并对其进行分离纯化及酶学性质研究。【结果】该木聚糖酶(Xyl4513)具有2个保守结构域,一个属于糖苷水解酶11家族(glycoside hydrolase family 11,GH11)催化模块(Xyl4513-T),另一个属于碳水化合物结合模块(carbohydrate-binding module,CBM)60家族(CBM4513),这是一种非常罕见的GH11家族木聚糖酶含有CBM的现象。纯化后的Xyl4513最适反应温度和pH值分别为30℃、3.0,这一特性说明Xyl4513为嗜冷嗜酸β-1,4-木聚糖酶;而截短的木聚糖酶Xyl4513-T最适反应温度和pH值分别为20℃、4.0,且催化效率(kcat/Km)较前者下降了20%,说明CBM4513对酶稳定性和催化效率有较大影响。Ca^(2+)、Mg2+和Ni2+对酶催化活性均有明显促进作用,其中Ca^(2+)效果更为明显。仅当含有Ca^(2+)时,CBM4513才对β-1,4-木聚糖具有特异性结合能力,属于Ca^(2+)依赖型CBM,其最大结合量为9.13μmol/g。【结论】本文获得了一种新型的嗜冷嗜酸木聚糖酶和相应的Ca^(2+)依赖型CBM,进一步丰富了它们的基因和蛋白资源。     

恶臭假单胞菌SJTE-1中转化17β-雌二醇的3-酰基-ACP还原酶的鉴定与功能研究（英文）

【目的】假单胞菌SJTE-1可高效转化17β-雌二醇,但是催化该转化的酶尚不清楚。本文鉴定了该菌株的一个新的3-酮酰基-ACP还原酶(ANI01589.1),并对其进行了功能研究。【方法】首先,我们克隆了该3-酰基-ACP还原酶的编码基因,在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中进行了异源表达;利用金属离子亲和层析法,纯化获得了重组蛋白。体外检测了重组蛋白的活性与酶学性质,并利用高效液相色谱法(HPLC)测定了该酶的催化产物。【结果】3-酮酰基-ACP还原酶可被17β-雌二醇诱导表达,重组蛋白纯化量可达19.6mg/L。蛋白序列比对结果表明,该蛋白包含短链脱氢酶/还原酶(SDR)的2个共有区域和多个保守残基。该酶以NAD~+为辅助因子,将17β-雌二醇转化为雌酮;其Km值为0.071 mmol/L, k_(cat)值为2.4±0.06/s~(–1),5 min内可转化超过95.8%的雌二醇。该酶的最佳反应温度为42°C,最佳pH为8.0。不同二价离子对该酶的活性影响不同,Mg~(2+)和Mn~(2+)可增强其酶活性。【结论】这一假单胞菌SJTE-1来源的3-酮酰基-ACP还原酶可高效催化17β-雌二醇的转化,该酶可能在该菌株的雌激素代谢过程中起到重要作用。     

褐藻胶裂解酶基因的克隆表达及重组酶酶学性质

【目的】克隆交替假单胞菌(Pseudoalteromonas sp.)BYS-2的褐藻胶裂解酶基因,实现其在大肠杆菌细胞中异源表达,对分离纯化的重组酶进行酶学性质研究。【方法】以交替假单胞菌BYS-2菌株基因组DNA为模板,克隆得到褐藻胶裂解酶基因alg738,构建重组基因工程菌BL21(DE3)/p ET22b-alg738,诱导表达,表达产物通过Ni-NTA树脂纯化后进行酶学性质研究。【结果】重组酶的最适反应p H为8.0,在p H 6.0-9.0范围内37°C保温1 h仍能保持84%以上的相对酶活力,具有较好的p H稳定性;最适反应温度为45°C,热稳定性实验显示在37°C下保温60 min其残余酶活力仍达66.6%;在5 mmol/L浓度下,Na~+、Mg~(2+)、Mn~(2+)对该酶具有明显的促进作用,Ni~(2+)、Co~(2+)、Cu~(2+)、Hg~(2+)、Zn~(2+)、EDTA、β-巯基乙醇、SDS具有明显的抑制作用。动力学参数Km、Vmax分别为1.11 g/L和0.011 g/(L·min),底物特异性分析表明该重组酶为偏好聚甘露糖醛酸钠(Poly M)裂解作用的双功能酶。【结论】重组褐藻胶裂解酶具有良好的酶学特性,为褐藻胶裂解酶的开发应用打下基础。     

卷枝毛霉中苹果酸酶同工酶V的酶学性质

【目的】探讨卷枝毛霉中苹果酸酶同工酶V的性质。【方法】克隆卷枝毛霉中编码苹果酸酶同工酶V的mel基因并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,利用His标签纯化获得了高纯度的重组酶BLME1,并进行酶学性质分析。【结果】该重组酶最适pH为8.0,最适温度为33℃,在此条件下酶活达到92.8 U/mg,对底物L-苹果酸和NADP~+的米氏常数K_m值为0.74960±0.06129 mmol/L和0.22070±0.01810 mmol/L,最大反应速度V_(max)分别为72.820±1.077 U/mg和86.110±1.665 U/mg。金属离子Mg~(2+)、Mn~(2+)、Co~(2+)、Ni~(2+)可以激活BLME1的活性,而Ca~(2+)、Cu~(2+)对BLME1活性则有抑制作用,中间代谢产物草酰乙酸和α-酮戊二酸也会抑制BLME1的活性,但琥珀酸却对BLME1有激活作用。【结论】本实验调查了卷枝毛霉苹果酸酶同工酶V的最适反应温度和pH、动力学参数,以及各种金属离子和中间代谢产物对酶活力的影响,这为以后深入研究该苹果酸酶的功能提供了理论依据和参考。     

联苯利用节杆菌YC-RL1中2,3-二羟基联苯-1,2-双加氧酶BphC功能验证

【目的】通过节杆菌(Arthrobacter sp.)YC-RL1对多氯联苯降解过程中关键基因bph C的克隆与原核表达,鉴定其编码的2,3-二羟基联苯-1,2-双加氧酶Bph C的酶活特性与功能。【方法】以菌株YC-RL1全基因组为模板进行PCR扩增获得bph C基因,将该基因转入Escherichia coli BL21(DE3)感受态细胞后进行原核表达;利用镍柱亲和层析法对Bph C酶进行纯化并分别测定该酶在不同条件下对底物2,3-DHBP的催化特性,确定其最适反应pH、温度及不同金属离子对酶活特性的影响;进一步根据米氏方程对该酶的动力学参数进行测定与分析。【结果】通过PCR扩增获得了bphC基因,其大小为930 bp;对该基因进行原核表达,所得重组蛋白BphC携带有6个组氨酸标签,经纯化后体外仍具有活性,该酶作用于2,3-DHBP时的最适pH与温度分别为pH 7.4和30°C,且在最适条件下,Fe~(2+)、Cu~(2+)及Cd~(2+)等金属离子可明显促进其酶活作用,但多数金属离子对该酶有不同程度的抑制作用;该酶在与底物2,3-DHBP作用过程中,酶促动力学常数分别为K_m:8.67 mmol/L,V_(max):27.32μmol/s,k_(cat):15.55 s~(–1),k_(cat)/K_m:1.79 L/(mmol·s),其催化效率同有关报道中同类酶的动力学特性比较均有所提高。【结论】菌株YC-RL中的bphC基因对于多氯联苯的生物降解具有至关重要的作用,其编码的BphC是重要的芳香环裂解酶,该酶对其底物具有较高的亲和性,可在体外环境中发挥高效的酶促作用,具有良好的应用价值。     

固定化细胞拆分(R,S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸甲酯的研究

【目的】筛选鉴定一株产酯酶用于选择性拆分(R,S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸甲酯的菌株,利用该菌株固定化细胞催化拆分外消旋底物。【方法】通过富集培养、罗丹明B平板初筛及复筛培养获得一株选择性拆分(R,S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸甲酯的菌株,通过对其形态、生理生化特征及16S r DNA序列分析,确立该菌株系统发育地位。优化了利用硅藻土-戊二醛吸附交联法对该菌体细胞固定化的条件,研究固定化细胞催化性质及操作稳定性。【结果】该菌为革兰氏阴性菌,鉴定其为甲基球状菌属(Methylopila)。固定化体系最优条件:聚乙烯亚胺0.15%(V/V),戊二醛0.2%(V/V),硅藻土6 g/L,菌体质量浓度100 g/L。与游离细胞相比,固定化细胞最适p H由8.0变为8.5,最适温度由35°C变为40°C,p H稳定性和温度稳定性都有所提高。Cu~(2+)、Mn~(2+)、Ca~(2+)能促进酶活,Zn~(2+)、Fe~(2+)抑制酶活。固定化细胞的有机溶剂耐受性较游离细胞有所提高。动力学分析细胞固定化后Km值变大,底物亲和力降低。利用固定化细胞水解(R,S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸甲酯,底物浓度200 g/L,反应20 h,保留构型为S型,得率47.8%,对映体过量值ees为99.4%,重复使用12次后仍保留初始酶活的80%以上。【结论】开发了利用Methylopila sp.cxzy-L013固定化细胞择性拆分(R,S)-α-乙基-2-氧-1-吡咯烷乙酸甲酯的工艺,该工艺具有良好的工业应用前景。     

牛脑Ca~(2+)/CaM依赖性蛋白激酶Ⅱ的纯化和鉴定

通过一系列层析法,首次从牛脑纯化得到胶凝电泳匀一的Ca~(2+)/CaM PKⅡ。凝胶过滤法测定全酶分子量为550kD,SDS-PAGE法测定亚基分子量为55kD,推测牛脑Ca~(2+)/CaM PK Ⅱ由十个相同的亚基组成。该酶活性绝对依赖于Ca~(2+)和CaM,以63kD PDE同工酶为底物,其AC_(50)分别为0.85μmol/L和0.18μmol/L;以酪蛋白为底物,其AC_(50)分别为0.22μmol/L和0.06μmol/L。牛脑Ca~(2+)/CaM PK Ⅱ旣能催化63kD PDE同工酶等多种蛋白或酶磷酸化,又能进行自身磷酸化。该酶催化63kD PDE同工酶最大磷酸参入量为1mol/mol亚基。磷酸化型63kD PDE同工酶的Ca~(2+)的AC_(50)高于非磷酸化型。     

Rhodococcus ruber CGMCC3090腈水合酶纯化、酶学性质及结晶研究

Rhodococcus ruber CGMCC309菌株为酰胺酶及腈水解酶双重缺陷菌株,研究表明该菌能产宽泛底物特异性的腈水合酶。对该菌株产生的新型腈水合酶(NHase-3090)进行纯化和结晶,并研究了其酶学性质。采用疏水、离子交换及凝胶过滤3种层析方法,使该酶纯化倍数达到17.14,得率高达26.2%。电泳分析表明,全酶分子量为105 kDa,由α(24.3 k Da)和β(28.0k Da)2个亚基组成,并构成α2β2四聚体。酶的最适p H和温度分别为7.5和30℃。该酶明显受不同金属离子影响。动力学研究表明,Km为178.8 m M;Vmax为209.1μmol/L·min·mg。研究发现3种金属离子Zn~(2+),CO~(2+)和Cd~(2+)有利于酶蛋白结晶。结晶最佳条件是:采用112-34#试剂(0.05mol/L水合硫酸镉、0.1mol/L HEPS和1.0mol/L三水醋酸钠),蛋白质浓度为15 mg/ml,结晶温度为16℃,p H为7.5,结晶时间为30 d。腈水合酶蛋白单晶经X射线衍射,分辨率达到了3.7。该腈水合酶的纯化和结晶为进一步深入研究其结构和功能奠定了基础。