昆虫神经毒性酯酶活性的测定

首次报道了针对昆虫建立的神经毒性酯酶(NTE)活性检测方法以及据此法所测得的棉铃虫幼虫的NTE活性。将测定脊椎动物NTE活性的方法改进并微量化以适用于无脊椎动物昆虫体内NTE活性测定。对于棉铃虫幼虫,该法测得其头部、中肠和脂肪体等3个部位的NTE活性分别为5.30,1.40和14.50nmolminmgprotein。     

工程菌P.pastoris GS115(pPIC9K-lac2)的构建及诱导表达漆酶的研究

用PCR法扩增枯草芽孢杆菌的漆酶基因lac2.构建表达质粒pPIC9K-lac2.通过电转法将lac2基因重组于P.pastoris基因组,筛选高G418抗性和高表达漆酶的转化子作为工程菌GS115(pPIC9K-lac2).在发酵罐中发酵GS115(pPIC9K-lac2)表达重组蛋白.在50 L发酵罐中加入20 L无机盐发酵培养基.在发酵的第一阶段连续24 h补加50％甘油-0.8％ PTM4增殖P.pastoris,然后用甲醇-0.8％ PTM4诱导49 h.在发酵过程中,通过调节搅拌的频率和通气量,将溶氧维持于20％ ～30％,用氨水维持pH 5.0.放罐时生物量为A600=266.5,表达漆酶1097.5U/L发酵液.     

用P.pastoris表达L-阿拉伯糖异构酶及其酶活性分析

目的:用毕赤酵母表达L-阿拉伯糖异构酶。方法:用PCR法扩增大肠杆菌的L-阿拉伯糖异构酶基因,构建含L-阿拉伯糖异构酶基因的毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K-ai。通过电转法将pPIC9K-ai转化毕赤酵母GS115基因组。先筛选出高G418抗性的克隆,然后再从高拷贝的克隆中筛选出高表达重组L-阿拉伯糖异构酶的重组子作为工程菌GS115(pPIC9K-ai)。结果:在甲醇诱导下,摇瓶发酵GS115(pPIC9K-ai)3d,分泌表达L-阿拉伯糖异构酶32 mg/L。结论:毕赤酵母表达的L-阿拉伯糖异构酶具有转化D-半乳糖为D-塔格糖的生物活性。每升GS115(pPIC9K-ai)发酵液能转化D-半乳糖生成30 mgD-塔格糖。     

哺乳动物精子发生中减数分裂的起始

生殖细胞的发生、增殖和分化是生命科学领域研究的重要课题之一. 生殖是所有动物赖以生存的基础,精子发生是完成繁殖所必须经历的过程,其最终目的是源源不断地产生单倍体精子.精子发生过程本身是一个复杂特殊的细胞增殖与分化过程,其中减数分裂是精子发生最重要的步骤,但关于减数分裂如何精确起始的分子机制仍知之甚少.已有报道发现,维甲酸（RA）调控Stra8可能是哺乳动物减数分裂起始的机制之一,Nanos2、Boule对RA-Stra8通路具有重要的调控作用. 本文对哺乳动物精子发生中减数分裂起始的相关研究进展进行综述.     

Stra 8基因的激活与精原干细胞的特异性分化研究

视黄酸对维持正常的雄性睾丸结构和功能起着重要的作用。近来的研究发现,在雄性生殖腺发育过程中有一组基因,它们可以被视黄酸特异性的诱导活化,称为Stra（Stimulated by Retinoic Acid）基因。从鼠源分离得到的Stra8 基因编码一种细胞质蛋白,该基因只特异性的在成熟雄性生殖细胞中表达,其功能被认为与精子形成有关。为研究Stra8 基因的表达特性,我们从小鼠的基因组中克隆了Stra8 基因的启动子序列（1.4kb）。将Stra8 基因的1.4kb启动子序列克隆到pEGFP-1载体的EGFP基因之前,构建成由Stra8 基因1.4kb启动子序列调控表达绿色荧光蛋白的pStra8-EGFP载体。将其分别转化到不同类型的细胞中,如小鼠ES-129细胞、人胎儿胰腺干细胞、小鼠骨髓间充质干细胞和小鼠精原干细胞等,通过荧光显微镜观察发现,绿色荧光蛋白只在小鼠精原干细胞中表达,表明Stra8基因是组织特异性表达的基因。将pStra8-EGFP转化小鼠骨髓间充质干细胞,经G418筛选2周后,用视黄酸诱导,12h培养后,有一部分转化pStra8-EGFP载体的细胞表达绿色荧光蛋白。RT-PCR证明这些细胞中有精原干细胞特异表达基因Stra8 的转录,还有生殖细胞特异表达基因CyclinA8 和Oct4的转录,这些结果说明小鼠骨髓间充质细胞经视黄酸的诱导可以向生殖细胞方向分化。     

以甘油为碳源发酵Pichia pastoris组成型表达人血管生成抑制素

在Pichia pastoris组成型表达外源蛋白中碳源起着重要的调控作用。分别以葡萄糖、甘油、甲醇和油酸为碳源研究它们对摇瓶发酵GS115(pGAP9K-AS)表达hAS的影响。结果如下:油酸(163mg/L),甘油(83mg/L),葡萄糖(76mg/L),甲醇(57mg/L)。根据以上结果,以甘油为碳源在30L生物反应器中进行GS115(pGAP9K-AS)工程菌的高密度发酵。48h后测得hAS的产量为169mg/L。产物hAS具有免疫活性并能抑制bFGF诱导的CAM血管生成和实验小鼠黑色素瘤的生长。治疗12d后,抑瘤率达到90%,统计学分析结果表明hAS治疗组和PBS治疗组小鼠的肿瘤体积呈现显著性差异(P<0.01)。     

Stra 8基因的激活与精原干细胞的特异性分化研究

视黄酸对维持正常的雄性睾丸结构和功能起着重要的作用。近来的研究发现,在雄性生殖腺发育过程中有一组基因,它们可以被视黄酸特异性的诱导活化,称为Stra(Stimulated by Retinoic Acid)基因。从鼠源分离得到的Stra8基因编码一种细胞质蛋白,该基因只特异性的在成熟雄性生殖细胞中表达,其功能被认为与精子形成有关。为研究Stra8基因的表达特性,我们从小鼠的基因组中克隆了Stra8基因的启动子序列(1.4kb)。将Stra8基因的1.4kb启动子序列克隆到pEGFP-1载体的EGFP基因之前,构建成由Stra8基因1.4kb启动子序列调控表达绿色荧光蛋白的pStra8-EGFP载体。将其分别转化到不同类型的细胞中,如小鼠ES-129细胞、人胎儿胰腺干细胞、小鼠骨髓间充质干细胞和小鼠精原干细胞等,通过荧光显微镜观察发现,绿色荧光蛋白只在小鼠精原干细胞中表达,表明Stra8基因是组织特异性表达的基因。将pStra8-EGFP转化小鼠骨髓间充质干细胞,经G418筛选2周后,用视黄酸诱导,12h培养后,有一部分转化pStra8-EGFP载体的细胞表达绿色荧光蛋白。RT-PCR证明这些细胞中有精原干细胞特异表达基因Stra8的转录,还有生殖细胞特异表达基因CyclinA8和Oct4的转录,这些结果说明小鼠骨髓间充质细胞经视黄酸的诱导可以向生殖细胞方向分化。     

文心兰OnFNR基因的克隆及抗软腐病功能鉴定北大核心CSCD

为了解铁氧还蛋白-NADP+氧化还原酶(FNR)在文心兰抵御软腐病过程中的作用,该研究采用RACE技术从文心兰‘小樱桃’中克隆到一条OnFNR基因(登录号为KX461908),分析其序列特性和编码蛋白亚细胞定位情况,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析其在不同组织部位以及不同软腐病感病阶段的表达模式,构建OnFNR过表达载体并转化文心兰原球茎(PLBs),对转基因原球茎进行软腐病抗性评价。结果显示:(1)文心兰OnFNR基因开放阅读框长为1080 bp,预测可编码含359个氨基酸、分子量为40066.14 Da、等电点为8.72的碱性蛋白;OnFNR具有典型的FAD结合结构域和NADP+结合结构域,定位于叶绿体。(2)多序列比对和进化树分析发现,OnFNR与其他植物LFNR聚为一类,并与小兰屿蝴蝶兰LFNR的相似度最高(89.1%)。(3)qRT-PCR结果显示,OnFNR在文心兰叶中的表达量最高,其次是假鳞茎与花,根中最低;文心兰植株接种软腐病病原菌1 d后叶片和假鳞茎的OnFNR基因表达量呈现极显著下调,并且在5个感病阶段的表达量均低于健康植株。(4)成功构建过表达载体pCAMBIA1301-OnFNR,并经农杆菌EHA105侵染成功转入文心兰PLBs,获得过表达OnFNR转基因原球茎16个;在过表达OnFNR文心兰PLBs中,OnFNR与Fd基因表达均呈现极显著上调,尤其是Fd表达量上调至对照(非转基因PLBs)的3.67倍,且过表达OnFNR的PLBs在软腐病病原菌侵染第4天的存活率仍有48.88%,而对照的存活率只有6.66%。研究表明,文心兰OnFNR是一个定位于叶绿体的光合型铁氧还蛋白-NADP+氧化还原酶,过表达OnFNR能够明显提高文心兰植株的抗病性,推测OnFNR在植物抵抗病毒以及ROS爆发中具有重要作用,且过表达OnFNR可能通过提高LET的电子传递效率,进而提高Fd的表达量达到促进MAPK通路信号传导的效果。     

基于转录组测序分析甜菜夜蛾卵巢细胞离体培养成系进程

【目的】本研究旨在分析甜菜夜蛾Spodoptera exigua蛹卵巢细胞建立细胞系的整个过程,探究细胞由体内到体外培养过程中其基因表达在转录水平的变化,为昆虫体外培养模型的建立提供理论基础。【方法】利用Illumina Hiseq测序平台对甜菜夜蛾蛹卵巢细胞离体培养过程中各阶段的细胞分别进行转录组测序,对获得注释的差异表达基因及其相关信号通路进行分析;通过荧光定量PCR对部分细胞周期相关基因(cycd和cdk4)、调控基因(cdc20,apc1,skp2和mad1)、增殖相关分子标志物(mcm4和pcna)在甜菜夜蛾卵巢细胞离体培养过程中的转录进行验证。【结果】甜菜夜蛾蛹卵巢细胞离体培养过程包括5个阶段:解剖获得离体的卵巢组织,卵巢组织贴壁培养后游离出原代细胞,细胞转化重新具备增殖能力,成功首次传代,以及能够连续传代15代以上建立细胞系。上述5个阶段的细胞经转录组测序、数据组装后共获得46 796条unigenes序列,组装得到序列长度完整性好;转录本unigenes序列拼接长度分布合理,样本碱基Q30均在94%以上。通过KEGG数据库获得注释的unigenes有1 473条,参与细胞过程紧密相关的20条信号通路,其中有92条unigenes在细胞周期信号通路中获得注释。聚类分析表明,在体内处于快速发育状态的卵巢细胞与同样处于增殖状态的细胞系基因表达模式非常接近。原代细胞由短暂停滞生长至成簇细胞的转化关键期,筛选到差异表达基因619个,cdk4在离体培养期表达量显著降低,cycd在细胞转化关键期之后表达量显著升高,cdc20,apc1,skp2和mad1在卵巢组织和细胞系的表达量显著高于原代细胞、转化关键期细胞和首次传代细胞的。从原代细胞至传代后,cycd的表达显著升高8.7倍,显著高于mcm4和pcna的变化水平。【结论】甜菜夜蛾卵巢细胞离体培养过程中5个阶段的细胞转录组测序获得的序列质量符合数据分析的基本要求。筛选获得了甜菜夜蛾蛹卵巢细胞经离体培养过程中的差异表达基因。原代细胞逆转增殖可能与cdk4,cycd,skp2和mad1等细胞周期调控基因表达有关。另外,cycd可作为原代细胞具备传代能力的标志物。     

绞股蓝核糖体失活蛋白家族编码基因的5 个cDNA 及其下游非编码区

通过3'RACE克隆策略获得绞股蓝(Gynostemma pentaphyllum)核糖体失活蛋白(ribosome-inactivating protein,RIP) Gynostemmin的5个cDNA序列gynostemminⅠ～Ⅴ及其下游非编码区(3' untranslated region, 3'UTR)。它们的编码区长度除gynostemminⅡ为825 bp外,其余均为831 bp。其下游非编码区的长度分别为279、174、170、161和171 bp。在3'UTR中,gynostemminⅠ比另外4个多了两个小的茎环结构和一富含AU的不稳定子元件,其mRNA的稳定性可能因此受到影响。