工程菌P.pastoris GS115(pPIC9K-lac2)的构建及诱导表达漆酶的研究

用PCR法扩增枯草芽孢杆菌的漆酶基因lac2.构建表达质粒pPIC9K-lac2.通过电转法将lac2基因重组于P.pastoris基因组,筛选高G418抗性和高表达漆酶的转化子作为工程菌GS115(pPIC9K-lac2).在发酵罐中发酵GS115(pPIC9K-lac2)表达重组蛋白.在50 L发酵罐中加入20 L无机盐发酵培养基.在发酵的第一阶段连续24 h补加50％甘油-0.8％ PTM4增殖P.pastoris,然后用甲醇-0.8％ PTM4诱导49 h.在发酵过程中,通过调节搅拌的频率和通气量,将溶氧维持于20％ ～30％,用氨水维持pH 5.0.放罐时生物量为A600=266.5,表达漆酶1097.5U/L发酵液.     

用pGAP启动子在P.pastoris中组成型表达漆酶

目的:用pGAP启动子在P.pastoris中组成型表达漆酶.方法:用PCR从枯草芽孢杆菌基因组中扩增漆酶基因lac2.用Not和EcoRⅠ双酶切将lac2基因重组于表达载体PGAP9K.通过电转法将其转化于P.pastoris基因组,筛选高G418抗性以及高表达Lac2酶的重组子作为工程菌Gs115( pGAP9k - lac2).用甘油作为碳源在50L生物反应器中表达重组漆酶Lac2.用ABTS法测定发酵液中的漆酶活力.结果:在发酵30h时,其Lac2酶的表达达峰值,其活性为136.67U/L.其峰值的Lac2酶的表达量为50mg/L.表达产物具有分解ABTs的活性.结论:成功克隆了漆酶基因lac2,并首次实现用pGAP启动子在P.pastorris中组成型表达漆酶,为用P.Pastoris规模化生产漆酶奠定了基础.     

高密度发酵P.pastoris诱导表达葡聚糖外切酶

目的:应用P.pastoris的pAOX1表达系统表达CBH Ⅱ酶.方法:PCR法扩增木霉的cbh Ⅱ基因.将其克隆进P.pastoris表达载体pPIC9k,电转法将其cbhⅡ基因重组于P.pastoris基因组,筛选高G418抗性的克隆为工程菌.重组CBH Ⅱ酶的生产是在50 L生物反应器中进行.连续24h补加甘油-PTM4增殖细胞,然后用甲醇诱导表达64h.结果:放罐时生物量为A600=180,重组CBHⅡ产量为80mg/L.表达产物具有酶解羧甲基纤维素的活性.结论:实现应用pAOX1表达系统在生物反应器中高密度发酵P.pastoris诱导表达CBH Ⅱ.该研究为重组CBH Ⅱ的规模化生产打下基础.