内脏团插核术刺激对三角帆蚌血细胞的影响

为了探讨三角帆蚌(Hyriopsis cumingii Lea)血细胞的类型及内脏团插核手术刺激对血细胞形态结构和数量的影响,研究利用相差显微镜、光学显微镜、透射电子显微镜和流式细胞仪对三角帆蚌血细胞进行了形态学研究。流式细胞术光散射图谱显示血细胞被分两类,一类为颗粒度高的大细胞,另外一类为颗粒度低的小细胞;相差显微镜观察显示,血细胞可分为胞体暗、折光性差和胞体明亮、折光性强的两类;Giemsa和H.E染色显示细胞分为胞质染色不均一、胞内颗粒明显和胞质染色均一、胞内颗粒不明显的两类;透射电镜超薄切片观察显示,颗粒明显的细胞胞质内线粒体、高尔基体等细胞器较丰富,颗粒不明显的细胞胞质内细胞器较少;负染结果表明血细胞主要分为表面不光滑、突起明显和细胞表面光滑、突起较不明显的两类。综合上述实验结果可见,三角帆蚌血细胞分为颗粒明显的细胞和颗粒不明显的透明细胞两大类。内脏团插核术刺激后,血细胞的形态和比例均发生显著变化。血细胞形态更多样,伪足状突起更明显,细胞内囊泡状物质增多,血细胞密度显著增高(PP<0.01)。研究表明,作为三角帆蚌免疫系统重要组成部分的血细胞,在插核手术后,其类型、形态结构和数量均产生明显变化,这是机体对外界刺激产生的免疫防御反应,其中颗粒细胞担负着主要的免疫功能。       

中华鲟铁蛋白基因cDNA全长克隆与组织表达分析(英文）

根据铁蛋白基因的保守序列,搜索GenBank数据库中华鲟的EST数据库得到一条同源序列。通过RT-PCR的方法对该序列进行扩增,修改其测序错误,获得中华鲟铁蛋白亚基cDNA全长,经过注释提交GenBank数据库,获取序列登录号EU348782。该cDNA长度为896 bp,包含531bp的完整编码区,推测编码的蛋白质为176 aa,分子量为20339.9 Mr,理论等电点为5.66。它和大西洋鲑鱼铁蛋白序列同源性最高,达到82.9%。该基因在中华鲟肝脏、胰脏、肌肉、脑、心脏、鳃和胃粘膜等多种组织表达,在胰脏和心脏中表达量较高,在肌肉组织中表达较低。根据同源模建的方法得到该蛋白质三维结构,其包括5个α螺旋和10个转角结构,和人、蛙和细菌的铁蛋白均能很好的叠合,表现了很高的相似性,表明该蛋白结构和功能在基因进化中的高度保守性。     

牙鲆甲状腺激素受体TRaA的原核表达和多克隆抗体的制备及应用

为研究牙鲆甲状腺激素受体TRαA在牙鲆变态发育过程中的调控作用,将TRαA基因克隆插入融合表达载体pET30a,并在大肠杆菌Escherichia coli DE3(BL21)中进行诱导表达。表达菌株经1mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导4h后,重组蛋白TRαA表达并形成包涵体。SDS-PAGE和Western blotting检测鉴定表达产物。包涵体经变性后在His-Bind树脂进行亲和层析纯化,柱上复性法对重组蛋白复性,获得纯度较高的目的蛋白,蛋白复性的效果良好。用纯化后的目的蛋白免疫新西兰家兔制备多克隆抗体。Dotblotting检测抗体效价达1:200000,检测证明抗体特异性良好。此外,通过染色质免疫沉淀技术鉴定了在活体细胞中多克隆抗体与TRαA的特异性结合,表明了甲状腺激素通过其受体在体内参与碱性磷酸酶(ALP)基因的转录调控。     

ARTP诱变对三角帆蚌外套膜细胞生长活性及其生物矿化相关因子的影响

为获取高活力的外套膜细胞, 研究通过常压室温等离子体(Atmospheric and room temperature plasma, ARTP)诱变和流式细胞术等技术分析了不同诱变气量组(10、12和15 SLM组)和处理时间对三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)体外培养的外套膜细胞的细胞活性及生物矿化相关功能的影响。结果表明: ARTP诱变360—900s能显著升高各组三角帆蚌外套膜细胞活力, 且在900s时达到最大值(P<0.05); 渗透压稳定剂的添加, 显著提高了诱变过程中12和15 SLM组在360—900s作用时间下的细胞活力(P<0.05), 其中12 SLM组外套膜细胞增殖指数显著上升至最大值(P<0.05); 诱变后细胞体外培养24h时结果显示, 12 SLM组720s的外套膜细胞活力显著达到最高(P<0.05); 15 SLM组(诱变时间为720s, 下同)SOD活力随着诱变气量的增大呈显著下降趋势, 且在15 SLM组显著降至最低水平(P<0.05), 相反, 微核率在15 SLM组达到最大值; 生物矿化分析表明, 外套膜细胞Ca2+的浓度、生物矿化相关的关键酶(碳酸酐酶、碱性磷酸酶)和钙调蛋白基因(Calmodulin, CAM)基因均在12 SLM组达到最大值(P<0.05), 而EFCB1(EF-hand calcium-binding domain-containing protein 1)基因结果显示在10 SLM组达到最大值(P<0.05), 12 SLM次之; 以上分析表明, 氦气诱变在气量为12 SLM, 处理720s时与渗透压稳定剂连用对外套膜细胞活性及其他生物学活性影响最为显著, 暗示氦气诱变可有效作用于外套膜细胞的离体培养, 为三角帆蚌建立细胞系提供生物学基础与新思路。     

西伯利亚鲟侧线神经丘发育过程的观察

研究对西伯利亚鲟(Acipenser baerii)的胚后幼鱼进行石蜡切片HE染色,同时利用荧光染料DiA4-(4-Diethylaminostyryl)-1-methylpyridinium iodide对侧线管中侧线神经丘毛细胞特异性标记的特点,示踪了西伯利亚鲟胚后仔鱼各个时期侧线神经丘分化发育的过程。结果显示,西伯利亚鲟侧线管内侧线神经丘毛细胞如纤毛状,呈竖立紧密排列。出膜3d仔鱼眼眶后神经基板发育分化活动剧烈,出膜10d的仔鱼眼眶后方的神经基板分化出眼眶上下侧线神经丘的两个分支,同时眼眶后神经基板进一步向后分化发育在眼眶后部形成躯干侧线神经丘,但整个侧线神经丘还未完全发育完成,待出膜15d时,眼眶上下和躯干侧线神经丘已基本发育完全,出膜22d的仔鱼侧线神经丘发育基本完成。研究为今后深入研究西伯利亚鲟侧线发育过程中的神经分化发育、细胞迁移奠定了初步形态学基础。       

牙鲆碱性磷酸酶基因5＇调控区的克隆及其功能检测

通过基因组步移的方法扩增出一段924bp的牙鲆碱性磷酸酶基因5＇调控区序列,在线软件分析表明5＇调控区内可能含有GKLF、Oct、CREB、E2F、CEBP、GATA-1、Pitx-1、Pit1、RARE／TRE、AP4等转录因子结合位点。采用DNA重组的方法,将克隆得到的5＇调控区片段插入启动子缺失的增强型绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-1中,构建重组表达载体pEGFP-JFALP。重组载体瞬时转染COS-7细胞,在倒置荧光显微镜下可以检测到绿色荧光信号,且荧光信号随着时间的延长而增强。结果表明本实验克隆的牙鲆碱性磷酸酶基因5＇调控区具有一定的启动子活性,为今后进一步研究碱性磷酸酶基因表达调控的分子机制奠定基础。     

应用于miRNA靶标检测的双荧光素酶报告载体的构建及鉴定北大核心CSCD

以牙鲆空通气孔同源框2基因(empty spiracles homeobox 2,emx2)为例,构建包含emx2 3'UTR区的野生型和突变型双荧光素酶重组报告表达载体,以期应用于mi RNA靶标的检测。利用Trizol法提取牙鲆成鱼精卵巢混合组织总RNA,参照已克隆出来的emx2基因c DNA序列,设计并合成emx2 3'UTR片段的引物并进行PCR扩增,将得到的基因片段和psi CHECK-2载体双酶切后,用T4 DNA Ligase酶进行连接反应,并转化入DH5α感受态细胞,筛选后得到野生型重组质粒;同时采用定点诱变法对emx2基因进行体外定点诱变并采用同样的方法形成突变型重组质粒。对野生型和突变型重组质粒进行双酶切、琼脂糖凝胶电泳鉴定及测序分析。成功克隆了emx2 3'UTR区,并将emx2 3'UTR区的mi RNA靶点序列GACTTGA突变为AGTCCAG,成功构建了野生型和突变型包含emx2 3'UTR区的mi RNA靶标检测载体。通过RT-PCR、基因重组及定点诱变技术成功构建了应用于mi RNA靶标验证的野生型和突变型双荧光素酶报告载体psi CHECK-emx2-3'UTR和psi CHECK-mutated-emx2-3'UTR。     

牙鲆碱性磷酸酶cDNA序列分析与蛋白质高级结构预测

为研究碱性磷酸酶(EC 3.1.3.1; alkaline phosphatase,ALP)在牙鲆(Paralichthys Olivaceus)发育和变态中的作用,采用RACE的方法克隆了牙鲆ALP基因cDNA全长,通过生物信息学分析了核苷酸序列并进行蛋白结构预测. 结果表明,牙鲆ALP cDNA全长为1 811bp,能编码476个氨基酸的蛋白质,分子量为52 293.1,等电点为7.67. 编码区核苷酸GC含量在ALP同源基因中差异比较大,脊椎动物明显高于非脊椎动物和细菌. 分子系统分析显示,牙鲆ALP和青黑斑河豚(Tetraodon nigroviridis)、斑马鱼（Danio rerio）的组织非特异性ALP有较高的同源性,分子进化树和物种进化树是一致的. 在蛋白序列中的一些重要的功能位点,包括金属离子结合位点、N糖基化位点和丝氨酸磷酸化位点等表现了较高的保守性. 牙鲆ALP和人胎盘ALP(PALP)在蛋白序列上有43%的相似性,其3D结构非常接近.通过氨基酸空间位置比较发现,牙鲆ALP中141和203位半胱氨酸对应于人PALP的121和183位半胱氨酸,推测能形成一个二硫键. 在两者酶活性中心,3个金属离子结合的氨基酸残基非常保守,Zn离子周围的9个氨基酸中有2个不同;Mg离子周围的7个氨基酸也只有2个不同,包括一对类似的丝氨酸155和苏氨酸175.     

三角帆蚌Nacrein基因克隆、蛋白提纯及其对珍珠晶体成型的影响

为研究三角帆蚌Nacrein蛋白对珍珠晶体成型的影响,通过巢式及3′-RACE PCR对三角帆蚌基质蛋白Nacrein基因3′端序列进行克隆,得到850bp碱基片段,分析表明其与合浦珠母贝同源基因序列相似度为56%,与马氏珠母贝相似度为50%。试验通过水提法初步分离出珍珠质水溶性基质蛋白,并采用快速蛋白液相色谱(fast protein liquid chromatography,FPLC)分离出分子量约为60kD的Nacrein蛋白。此外,采用配对试验设计,对试验组外套膜组织培养样品加入Nacrein蛋白,研究Nacrein蛋白对晶体成型的影响,结果显示,加入Nacrein蛋白的试验组结晶成棱形状;而未加Nacrein蛋白的对照组结晶成雪花状,而且在晶体形成的时间上,试验组也较之对照组要早。研究表明,Nacrein蛋白能加速外套膜组织分泌的钙质形成棱状结晶,从而对晶体成型产生影响。本研究为进一步研究基质蛋白对生物矿化的作用提供试验依据,对珍珠培育生产有一定指导意义。     

牙鲆甲状腺激素受体TRαA介导甲状腺激素调控的靶基因鉴定

为了鉴定牙鲆甲状腺激素受体TRs介导甲状腺激素调控的靶基因, 研究采用RT-PCR克隆了TRαA基因的CDS区, 并构建了p3×Flag-TRαA重组真核表达载体;该重组质粒转染HEK293T细胞后, RT-PCR、实时定量PCR与Western blot检测均表明牙鲆TRαA在哺乳动物蛋白表达系统中成功转录并翻译;且重组质粒转染的细胞裂解液通过G1亲和层析柱纯化、过滤除菌可得到纯的融合蛋白3×Flag-TRαA, 然后双荧光素酶报告实验通过在HEK293T细胞中共转染p3×Flag-TRαA和含候选靶启动子的报告基因表达载体pGL3-Pro-atoh8-1517/1333/708, 表明TRαA受体结合在atoh8基因启动子区–1497— –688特异的2个TRE识别序列来调控该基因的转录, 即atoh8是TRαA介导甲状腺激素直接调控的靶基因。研究为深入探究甲状腺激素受体TRαA介导甲状腺激素调控的信号通路提供了基础依据。