中华鲟铁蛋白基因cDNA全长克隆与组织表达分析

根据铁蛋白基因的保守序列,搜索GenBank数据库中华鲟的EST数据库得到一条同源序列.通过RT-PCR的方法对该序列进行扩增,修改其测序错误,获得中华鲟铁蛋白亚基cDNA全长,经过注释提交GenBank数据库,获取序列登录号EU348782.该cDNA长度为896bp,包含531bp的完整编码区,推测编码的蛋白质为176aa,分子量为20339.9Mr,理论等电点为5.66.它和大两洋鲑鱼铁蛋白序列同源性最高,达到82.9%.该基闪在中华鲟肝脏、胰脏、肌肉、脑、心脏、鳃和胃粘膜等多种组织表达,在胰脏和心脏中表达量较高,在肌肉组织中表达较低.根据同源模建的方法得到该蛋白质三维结构,其包括5个α螺旋和10个转角结构,和人、蛙和细菌的铁蛋白均能很好的叠合,表现了很高的相似性,表明该蛋白结构和功能在基因进化中的高度保守性.     

星星草铁蛋白基因PtFer的克隆及表达分析

目的:从星星草中克隆一个铁蛋白相关基因,分析其序列特征及基因表达模式。方法与结果:构建星星草RACE cDNA文库,根据GenBank中报道的铁蛋白基因EST序列设计引物,利用RACE方法克隆得到星星草铁蛋白基因PtFer的全长cDNA序列(GenBank登录号为HM125047);序列分析表明,PtFer的核苷酸序列长度为751 bp,开放读框为336 bp,编码111个氨基酸残基,预测蛋白质相对分子质量为12.8×103。其蛋白质序列具有铁蛋白的特征性保守区域,与水稻属同一进化分支,与其他禾本科植物铁蛋白的序列相似性达80%以上。Northern杂交分析表明,PtFer的表达量随Na2CO3的浓度和时间的增加而升高,并在12～24 h内持续保持较高的表达水平。结论:用分子生物学及生物信息学技术克隆并分析了星星草铁蛋白基因PtFer的全长cDNA序列及编码蛋白的结构,并初步探索了盐碱胁迫下其表达模式,为研究植物耐盐碱机理奠定了基础。     

人类β-1,4-半乳糖苷转移酶Ⅲ基因的分离与克隆

以人、牛、鼠、鸡、蜗牛的β-1,4-半乳糖苷转移酶催化区的编码核苷酸序列为探针,在NCBI GenBank EST数据库中进行同源搜寻,获得若干有高度同源的EST.在拼接序列的两端设计引物,以从人胎盘cDNA文库中PCR扩增获得的片段为探针,在人胎盘cDNA分子库中步移获得一个长1,907bp的cDNA片段,包含一个长1,179bp的开放阅读框(ORF,open reading frame),编码393个氨基酸残基。该基因与已知的人类β1,4-GalTI的氨基酸同源性为43.8%,在蛋白质催化区的同源性更高达60.9%。表达谱分析发现该基因在人体16种组织中均有不同程度的表达,转录本大小约为2.4kb.通过该cDNA人/啮齿类杂种细胞株DNA Southern杂交将该基因定位在1号染色体。     

大白菜碳酸酐酶基因的克隆与序列分析

以大白菜雄性不育系和保持系花蕾差异表达片段EST H9为信息探针,在GenBank数据库中进行同源EST序列检索,并对亲缘关系近的同源EST序列进行拼接,得到大白菜EST H9的5'-cDNA序列.根据拼接组装所得的5'-cDNA序列,进行3'-RACE引物的设计,经RACE扩增、测序,获得了大白菜α-碳酸酐酶3基因的cDNA全长序列并将其登录到GenBank(登录号为GU143061),命名为BrACA3.该cDNA全长998 bp,编码270个氨基酸.同源分析显示该cDNA序列推导的氨基酸序列与拟南芥α-碳酸酐酶3一致性达78%.氨基酸序列分析表明,该蛋白具备跨膜功能,在第19和20个氨基酸之间存在一个信号肽序列,存在丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸磷酸化位点.在大白菜花蕾败育过程中α-碳酸酐酶3基因不表达,只在保持系B7的大花蕾时期表达.     

成人视网膜假定蛋白基因ARHP的克隆及生物信息学分析

从UniGene库中选取编号为BG2 2 2 62 4来自人鼻咽组织的表达序列标签 (EST )序列 ,联网到NCBI调用Blast服务器分析 ,发现该EST序列是一个代表新基因的未知序列 .利用Blast检索GenBank的nr数据库和EST数据库 ,构建EST重叠群 ,联网到NCBI的ORFfinder服务器 ,分析发现该EST重叠群具有完整的阅读框架 .分别在cDNA序列阅读框架的起始密码子和终止密码子的两侧设计引物 ,以人胎脑cDNA文库为模板 ,进行PCR扩增 ,测序确定该基因的cDNA全长序列 .该基因cDNA序列全长为 1672bp ,阅读框架位于第 3 0 4～ 1557位之间 ,编码由 417个氨基酸组成 ,分子质量为 46 58ku的蛋白质 ,其理论 pI为 4 2 1.将蛋白质序列通过NCBI的Blast服务器进行序列相似性分析 ,发现该基因编码的蛋白质和成年小鼠视网膜未知蛋白 (BAB3 2 2 14 )同源 .经与国际人类基因组命名委员会协商定名为成人视网膜假定蛋白 (adultretinahypotheticalprotein ,ARHP) ,GenBank登录号为AY174896.生物信息学分析表明 ,该蛋白质可能为一参与转录调控的核蛋白 .ARHP基因定位在染色体 5q3 5,跨越 3 5163bp ,含 4个外显子和 3个内含子 .在基因的 5′非翻译区有 2个CpG岛     

棉花nodulin—like基因及其启动子的结构特征和遗传表达

用同尾酶反向PCR技术(Ⅱ-PCR)和快速分离目的基因cDNA　5'未知序列方法(RICUP)首次从陆地棉品种Y18　(Gossypium　arboreum　L.　Y18)中分离到nodulin-like基因的全长cDNA、DNA和启动子序列。结果表明,该基因全长为2　353　bp,具有5个内含子和6个外显子。cDNA全长1　480　bp,含有一个1　125　bp的ORF结构,编码375个氨基酸,在GenBank　nr数据库中没有与之同源的基因序列,在EST数据库中仅有一条733　bp的亚洲棉纤维EST序列(GenBank登录号:BF271235)与之有92%的同源性。Nodulin-like基因的启动子全长1　969　bp,启动子区域具有Initiator、TATA　box、CAAT-like　box和富含AT序列等启动子特征序列。Southern　blot结果表明:该基因在棉花基因组中有一个拷贝。Northern　blot结果表明:该基因在棉花的蕾、花、纤维和铃壳等生殖器官中呈优势表达。本研究有望为改良棉花生殖器官的农艺性状提供靶基因,并为解决目前转基因抗虫棉“前期抗虫性强、后期抗虫性弱”这一生产实际问题提供有效的表达调控元件。     

棉花nodulin-like基因及其启动子的结构特征和遗传表达

用同尾酶反向PCR技术(Ⅱ-PCR)和快速分离目的基因cDNA 5'未知序列方法(RICUP)首次从陆地棉品种Y18(Gossypium arboreum L.Y18)中分离到nodulin-like基因的全长cDNA、DNA和启动子序列.结果表明,该基因全长为2 353 bp,具有5个内含子和6个外显子.cDNA全长1480 bp,含有一个1125 bp的ORF结构,编码375个氨基酸,在GenBank nr数据库中没有与之同源的基因序列,在EST数据库中仅有一条733 bp的亚洲棉纤维EST序列(GenBank登录号:BF271235)与之有92%的同源性.Nodulin-like基因的启动子全长1 969 bp,启动子区域具有Initiator、TATA box、CAAT-like box和富含AT序列等启动子特征序列.Southern blot结果表明:该基因在棉花基因组中有一个拷贝.Northern blot结果表明:该基因在棉花的蕾、花、纤维和铃壳等生殖器官中呈优势表达.本研究有望为改良棉花生殖器官的农艺性状提供靶基因,并为解决目前转基因抗虫棉"前期抗虫性强、后期抗虫性弱"这一生产实际问题提供有效的表达调控元件.     

大麦铁蛋白基因(HvFer1)cDNA的克隆和表达

根据玉米铁蛋白ZmFer1的氨基酸序列,采用同源序列法进行序列拼接和引物设计,RT-PCR扩增获得了1个源自二叶期大麦叶片mRNA的大麦铁蛋白基因cDNA片段,HvFer1(GenBank登录号为EF440353)。HvFer1全长1023 bp,5′非翻译区56 bp,3′非翻译区202 bp,开放阅读框编码254个氨基酸。序列分析表明,此蛋白与已知植物铁蛋白高度同源,相似性介于56.7%～83.7%之间,N端具27个氨基酸的信号肽,C端(84～247)具有1个类似铁蛋白的功能域。RT-PCR表达谱分析显示,HvFer1在大麦的茎、叶、幼穗和幼根均能表达,茎和幼穗中表达量略高些。此外,HvFer1受PEG和盐胁迫的强烈诱导表达,中度铁胁迫也可不同程度地增加HvFer1的表达量。     

心脏特异新基因Lrrc10的分子克隆与特性分析

采用表达序列标签(EST)介导的基因克隆和表达谱分析,从小鼠心脏克隆了一个心脏特异新基因Lrrc10（GenBank Acc No. AF527781）.该基因cDNA全长为1 410 bp,定位于小鼠染色体10D2,在基因组中无内含子.Lrrc10的最大开放阅读框编码的假想蛋白由274个氨基酸组成,含有7个亮氨酸重复基序.同源性检索未发现有整体同源性的已知基因.EST数据库中支持该基因cDNA序列的全部18条EST均来自小鼠心脏组织.对小鼠的不同组织cDNA的RT-PCR检测证实该基因主要在心脏中强表达,在肺低表达,而在其他组织中不表达或表达很弱.因此该基因是心脏特异的富亮氨酸重复超家族新成员.     

一个人类新基因ZNF322的研究初报

利用果蝇心脏发育基因zfh-1的cDNA序列和计算机克隆方法,在9号染色体上发现了一个新的人类同源基因,经国际基因全程委员会批准,命名为ZNF322。该基因总长度约为2.8kb,为一个连续的序列,编码一个402个氨基酸的蛋白质,与小鼠zfp-25编码的蛋白质最相似（同源度为51.4%）。该基因在人体肾、脑、结肠、胚胎心脏及黑色素瘤等多种组织中广泛表达,其功能有等深入研究。     

大豆GmPDS基因的克隆及VIGS表达载体构建和鉴定

病毒诱导的基因沉默(virus induced gene silencing,VIGS)技术是近年来发展起来的一种反向遗传学快速研究基因功能的方法,对于植物特别是难于转化的大豆而言尤其适用。本研究采用PCR技术从大豆(Glycine max)基因组中克隆了八氢番茄红素去饱和酶(phytoene desaturase,PDS)基因的部分序列,命名为GmPDS(Glycinemax PDS)。该片段长430bp,序列分析表明,该基因与大豆八氢番茄红素去饱和酶(GenBank登录号:M64704)cDNA序列同源性为99%。双酶切GmPDS片段和烟草脆裂病毒载体(pTRV2),构建了重组载体pTRV2-GmPDS,并将该重组载体分别转化农杆菌C58C1/pMP90、GV3101和LBA4404,为分析pTRV载体是否可以浸染大豆奠定了基础。     

马铃薯Alfin1-like锌指蛋白基因克隆与序列分析

利用紫花苜蓿盐胁迫相关锌指结构蛋白Alfin1基因cDNA序列,通过电子克隆在GenBank中对马铃薯同源EST序列进行查询比较和拼接,获得了1个含有完整编码区的cDNA序列,并通过RT-PCR成功获得了该序列.获得的全长cDNA序列中包含1个747 bp的最大读码框,编码248个氨基酸,将其命名为Stfin1.氨基酸序列分析表明存在典型的Cys4-His-Cys3锌指结构,与Alfin1一致性达93.09%.从结构分析结果推测Stfin1与Alfin1在功能上具有一定的相关性.     

水稻葡萄糖-6-磷酸脱氢酶cDNA的电子克隆

电子克隆是基因克隆的新策略,以小麦胞质葡萄糖－6－磷酸脱氢酶cDNA(Tagpdl克隆）序列为信息探针,在GenBank水稻nr数据库中找到高度同源的水稻基因组序列,通过人工序列拼接及RT-PCR确认得到了水稻该基因的全长cDNA序列,命名为OsG6PDH,OsG6PDH与小麦Tagpdl克隆的DNA一致率为88％,推导的氨基酸序列与小麦,番茄,烟草的胞质葡萄糖－6－磷酸脱氢酶基因的一致率分别为89％,79％,80％,经RT－PCR表达谱分析,OsG6PDH在水稻幼穗,胚,根,叶中都有表达,在幼穗与根中表达略高,另外,讨论了利用水稻基因组信息的电子克隆方法克隆水稻功能基因的可行性。     

新型小鼠淋巴组织特异性肌动蛋白结合蛋白相关序列cDNA克隆

 应用抑制性差减杂交技术 ( SSH)克隆两种不同小鼠胸腺基质细胞的差异表达基因 ,获得新基因片段 C55.通过 Gen Bank检索及 RT- PCR扩增出一个全长 1 .4kb的 c DNA.杂交分析认为它是一个完整的 c DNA序列 .c DNA序列分析表明 ,它拥有一个 636bp的开放读码框架 ,编码 2 1 2个氨基酸 .同源序列比较发现 ,它编码一个肌动蛋白相关蛋白的新成员 ,该序列与多种已知的肌动蛋白相关蛋白 SM2 2 α及其同源蛋白在氨基酸水平上有 62 %～ 95%的同源性 .Northern杂交分析显示 ,该基因 m RNA转录本在两种不同胸腺基质细胞中的表达存在显著差异 . RT- PCR分析显示 ,该基因特异表达于小鼠淋巴相关组织中 ,而在非淋巴组织中无表达 .     

小麦NBS-LRR类抗病基因同源cDNA序列的分离与鉴定

利用抗病基因的保守结构设计引物,从抗叶锈病近等基因系材料TcLr24中扩增出一条703bp的条带RGAl,通过与GenBank比对,选取与RGAI高度同源的若干条带,在它们共有的保守序列位置设计引物,利用cDNA末端快速扩增(RACE):ffL术扩增抗病同源基因cDNA全长.扩增到3条全长cDNA,经BLASTp比较,这些序列都舍有NBS保守结构域和多个LRR结构域.与很多已知植物抗病基因的功能相应区域一致.对FRGA-1,、FRGA-2和FRGA-3实时定量PCR分析,表明这3个基因在小麦叶片中都是组成型表达.本研究在小麦材料TcLr24中得到3条抗病基因同源cDNA全长,为研究小麦抗病基因奠定了基础.     

利用锌指基序的保守性从人脑组织分离新的C_2H_2型锌指蛋白基因表达序列

本文利用锌指基序的保守性设计引物,在低严谨条件下扩增人基因组总DNA,获得8个长度呈梯度的PCR扩增产物电泳条带。取其中第2和第3电泳条带,回收DNA片段并将它们克隆,经测序和查新比较,共获得60个含有锌指蛋白基因基序的单一的序列,其中23个为新的锌指蛋白基因DNA片段。以它们为探针,杂交筛选人脑组织cDNA文库,得到初筛cD-NA克隆44个。对其中28个初筛cDNA克隆进行复筛之后,得到20个cDNA单克隆。对这些阳性克隆进行测序,读出18个含有锌指蛋白基因基序的序列,国际联网查新之后,证明其中16个是新的锌指蛋白基因片段。这些新的锌指蛋白基因片段为今后克隆有意义的全长锌指蛋白cDNA提供了重要的实验材料。     

Isolation of novel expression sequences of C2H2 type zinc finger protein gene from human brain tissue according to the conservation of zinc finger motif]

By low stringency PCR amplification of genomic DNA using the primers designed based on the conservation of zinc finger motif, we got 8 gradient eletrophoretic bands. After recovery of the second and third bands, the DNA fragments in them were cloned and sequenced. Compared to the GenBank database, among these 60 segments containing zinc finger motif, 23 segments were novel zinc finger genes' genomic segments. Then the human brain tissue cDNA library was screened, using these segments as probes, and 44 positive clones were obtained. Rescreening 28 of them, we got 20 rescreened clones. All of them were sequenced and sent to the GenBank DNA database for sequence analysis, the results showed that 16 were novel C2H2 type zinc finger protein cDNA segments. The cDNA segments encoding the novel C2H2 type zinc finger proteins provide the basic materials for cloning of full length cDNA of valuable novel zinc finger protein genes.