一株抗蓝舌病病毒8型VP2蛋白单克隆抗体识别的线性抗原表位的鉴定

为研究本实验室制备的一株抗蓝舌病病毒8型(BTV-8)VP2蛋白的单克隆抗体(MAb)3G11识别的B细胞抗原表位,利用噬菌体肽库展示技术对3G11识别的抗原表位进行筛选并鉴定。经过4轮淘选后挑取蓝斑测序,测序结果经分析后获得KLLAT序列,与BTV-8 VP2蛋白氨基酸序列比对后获得共同的短肽序列为283LL284;合成4种短肽序列:KLLAA、KALAT、KLAAT和KLLAT,与3G11细胞上清和腹水分别进行间接ELISA鉴定,结果表明,短肽KLLAA和KLLAT与3G11细胞上清及腹水具有较强的结合能力;与24种BTV标准阳性血清反应结果表明,这两种短肽都可与BTV-8阳性血清发生特异性反应;序列分析结果可见,该表位的氨基酸序列283LL284在不同来源的BTV-8毒株间保守,确定283LL284为MAb3G11识别抗原表位的关键氨基酸。本研究为建立8型BTV特异性的免疫学检测方法和相关病毒蛋白的功能研究奠定了基础。     

重组猪乳铁蛋白N端的高效表达及抑菌活性检测

为获得表达猪乳铁蛋白基因的重组菌株,并检测其表达的重组猪乳铁蛋白抑菌活性,应用RT-PCR方法从泌乳3d后母猪乳腺组织中扩增了猪乳铁蛋白N端1077bp的PLF-N基因片段,与GenBank上发表的4株猪乳铁蛋白基因序列相比,核苷酸同源性均达到99%以上。为了得到高表达量的PLF-N基因,以扩增的PLF-N片段为参考模板,经过密码子优化,全基因合成了编码猪乳铁蛋白N端的基因PLF-NS。将其定向插入到原核表达载体pET-30b中,转化大肠杆菌BL21,获得了表达PLF-NS的重组菌pET-PLF-NS/BL21;经IPTG诱导,并对表达条件进行优化,以及通过SDS-PAGE和Western blotting分析均表明猪乳铁蛋白得到了正确表达,其产物分子量约为42kDa,最优表达条件下蛋白表达量占菌体总蛋白的32%,表达产物以包涵体形式存在。包涵体经裂解、纯化、复性处理后纯度达到98%。用琼脂孔穴扩散抑菌法检测表明重组猪乳铁蛋白具有明显的抑菌作用。表明通过基因优化对表达量低的基因进行改造使之高效表达,是一种提高表达效率的有效手段。     

猪细小病毒VP2蛋白在干酪乳杆菌表面的表达

将编码猪细小病毒主要免疫保护性抗原VP2基因插入干酪乳杆菌细胞表面表达载体pPG中,构建了重组表达载体pPG-VP2,将其电转化干酪乳杆菌Lactobacillus casei 393,获得了表达猪细小病毒VP2蛋白的重组干酪乳杆菌系统,经2%乳糖在MRS培养基中的诱导表达,SDS-PAGE检测表明,有约74kD蛋白得到了表达,表达蛋白的大小与理论值相符。Western-blot结果分析表明,表达的蛋白可被鼠源PPV抗血清所识别,间接免疫荧光实验结果表明,所表达的蛋白能够在干酪乳杆菌菌体表面检测到。     

表达猪传染性胃肠炎病毒S基因的重组乳酸乳球菌的构建及免疫原性分析

根据猪传染性胃肠炎病毒纤突(S)蛋白的全基因序列及表达载体质粒的基因融合特点,设计一对引物,进行PCR扩增,获得含有TGEVS基因4个主要抗原位点的约2000bp的目的片段,将其与分泌表达的载体质粒pNZ8112进行连接,通过电击转化进入宿主菌乳酸乳球菌NZ9000细胞内,在乳链菌肽(Nisin)的诱导下进行表达,通过SDS-PAGE和Western blot分析,表明TGEVS蛋白在乳酸乳球菌中获得表达,所表达的TGEVS蛋白具有与TGE病毒一样的抗原特异性。间接免疫荧光试验表明重组菌表达蛋白定位于菌体表面。将表达TGEVS蛋白的重组乳酸乳球菌及空质粒菌株分别口服免疫BALB/c小鼠,收集粪便样品进行抗体检测,结果表明分泌型的重组菌pNZ8112-Sa/NZ9000免疫小鼠能够产生明显的抗TGEVsIgA抗体。     

表达猪传染性胃肠炎病毒S蛋白重组乳酸乳球菌在模拟动物胃肠道内的稳定性检测

为确定本实验室研究构建的表达猪传染性胃肠炎病毒S蛋白重组乳酸乳球菌pNZ8112-Sa/NZ9000在模拟动物肠道内稳定性,对重组菌株的培养条件、蛋白表达和质粒携带以及在模拟胃肠道环境中的稳定性进行了检测。实验结果表明能够保持其蛋白表达的稳定性及重组质粒的稳定性;模拟胃肠道环境实验结果表明重组菌能够耐受胰蛋白酶溶液、0.1%的胆汁及在含有胃蛋白酶pH 1.5的盐酸存活1 h和在pH 2.5的盐酸耐受性良好。     

猪乳铁蛋白在4种重组乳杆菌中的表达及抑菌活性比较

为了获得优化的猪乳铁蛋白乳杆菌表达系统,并比较重组猪乳铁蛋白的抑菌活性,根据乳杆菌使用密码子的偏嗜性优化合成猪乳铁蛋白成熟肽编码序列,将其克隆到乳杆菌表达载体pPG612.1的XhoⅠ/BamHⅠ位点,获得了plf乳杆菌表达载体质粒pPG612.1-plf。将获得的重组质粒分别电转化入干酪乳杆菌ATCC393、戊糖乳杆菌KLDS1.0413、植物乳杆菌KLDS1.0344和副干酪乳杆菌KLDS1.0652细胞内,获得4种表达猪乳铁蛋白的重组乳杆菌。经木糖诱导,通过Western blotting和激光共聚焦检测重组猪乳铁蛋白的表达,用ELISA方法检测和比较4种重组菌上清中表达猪乳铁蛋白的量,并用琼脂孔穴扩散抑菌法检测4种重组乳杆菌表达乳铁蛋白的抑菌活性。结果表明,乳铁蛋白在4种重组乳杆菌中均得到正确表达,其产物分子量约73 kDa,重组干酪乳杆菌、重组戊糖乳杆菌、重组植物乳杆菌和重组副干酪乳杆菌的重组猪乳铁蛋白表达量分别为9.6μg/mL、10.8μg/mL、12.5μg/mL、9.9μg/mL。重组猪乳铁蛋白对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、巴氏杆菌和李氏杆菌均有一定的抑菌作用,对金黄色葡萄球菌的抑菌作用最强,且4种重组乳杆菌中重组植物乳杆菌表达产物的抑菌效果优于其他重组菌的表达产物。结果表明在4种乳杆菌中重组猪乳铁蛋白的最佳表达系统为植物乳杆菌,该结果为猪乳铁蛋白的乳杆菌表达系统进一步开发与应用奠定了基础。