糖苷合酶应用于糖蛋白和鞘糖脂的合成

糖苷合成酶是糖苷酶的亲核体氨基酸突变酶,催化寡糖的高效合成,可应用于寡糖的大规模生产。最近,糖苷合成酶被成功地应用于两类重要的生物分子——糖蛋白和鞘糖脂的高效合成,这必将对糖生物学和制药业的发展起到重要的推动作用。     

中生菌素生物合成基因zpsA的克隆及序列分析

利用PCR技术,首次从淡紫灰链霉菌海南变种（Streptomyces Lavendulae var. hainanensis）的基因组克隆出了中生菌素生物合成基因簇中的负责β-赖氨酸活化的zpsA基因。根据国外已报道的诺尔丝菌素肽合成酶基因（npsA）和链丝菌素肽合成酶基因（sttA）的保守序列以及链霉菌基因密码子的偏爱性,设计简并引物;以中生菌素高产菌株UV-69的总DNA作为模板进行PCR,先后得到长度分别为O．284kb、0．611kb、0．34kb和0．371kb的PCR产物,经测序后拼接得到1．025kb的zpsA基因片段。在GenBank中的进行比对分析,发现ZasA与NpsA、SttA的功能相同,都具有非核糖体肽合成醇腺苷酸化域（A域）的功能。     

逆境诱导水稻谷胱甘肽合成酶基因的表达研究

用RACE方法获得了全长的水稻谷胱甘肽合成酶(GS)基因的cDNA,并命名为OsGS(GeneBankaccession No.:AY453405)。该cDNA全长1 892 bp,编码一个由540个氨基酸组成的多肽,预测其氨基端(N端)含有一段定位叶绿体的信号肽。比较水稻基因组定位结果表明OsGS基因位于水稻12号染色体短臂上,转录区全长6 321 bp,由12个外显子和11个内含子组成。通过RT-PCR对OsGS在水稻正常生长条件和逆境条件下的表达进行了研究。结果表明,在正常生长条件下,OsGS在水稻幼苗的根和叶以及抽穗期水稻的根中表达;但不在抽穗期水稻的叶、茎和幼穗中表达,这显示OsGS在水稻中的表达具有发育和组织特异性。利用抽穗期水稻的叶片为材料,经高温、干旱和重金属逆境处理后,OsGS在抽穗期叶片中的转录被诱导表达;而在盐、低温、伤害逆境下则不被诱导。在轻度和中度干旱胁迫4 h后OsGS基因可被诱导表达。外源ABA处理也能够提高OsGS的转录水平,这显示OsGS可能是依赖ABA信号途径的环境胁迫诱导基因。     

猫爪草提取物对结核分枝杆菌临床分离株的可能作用靶标

利用双向电泳技术, 对猫爪草提取物作用前后的结核分枝杆菌临床分离株的全细胞蛋白表达图谱进行差异比较和分析, 发现其中22个蛋白质斑点的浓度具有差异,利用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱技术, 对其中4个表达明显下调和1个明显上调的蛋白质斑点进行分析鉴定, 获得5个明确的肽质量指纹图谱.通过数据库检索, 确定这5个蛋白质分别为S-腺苷甲硫氨酸合成酶、吲哚-3-甘油磷酸合酶、烯酰-CoA水合酶、琥珀酰辅酶A合成酶和60 kD的分子伴侣2.其中前4个分子是首次报道参与结核分枝杆菌的重要生理活动.该结果有助于了解猫爪草提取物对结核分枝杆菌生理的影响, 为进一步确定中药猫爪草提取物对结核分枝杆菌的作用靶标和机理提供了基础.     

大肠杆菌trpBA基因的克隆表达

目的:提高大肠杆菌中色氨酸合成酶的表达量和表达活性。方法:利用PCR方法从大肠杆菌K-12的基因组中直接克隆出紧密连锁trpB和trpA基因(简称trpBA),并将其连接到原核表达载体pet22b( )中,得到重组质粒pet22b( )-trp-BA,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导重组蛋白表达,表达产物经SDS-PAGE分析并用比色法测定其活性。结果:凝胶电泳可见PCR扩增产物大小约为2kb,SDS-PAGE鉴定目的蛋白的Mr分别约为29000和44000,色氨酸合成酶α、β亚基分别得到了高效表达,色氨酸合成酶活性提高到对照菌的3.7倍。结论:成功构建了重组质粒pet22b( )-trpBA,色氨酸合成酶的表达量和表达活性在大肠杆菌中得到了提高,为高产色氨酸基因工程菌的构建奠定基础。     

苦荞查尔酮合成酶基因CHS的结构及花期不同组织表达量分析

采用同源克隆、染色体步移和RT-PCR技术,首次克隆到苦荞查尔酮合酶基因（CHS）的全长DNA序列和cDNA开放阅读框（ORF)序列. 序列分析表明,苦荞CHS DNA序列（GU172165）全长1 632 bp,含1个445 bp的内含子;cDNA编码区（HM852753）全长1 188 bp,编码395个氨基酸,命名为FtCHS. 生物信息学分析表明,FtCHS和推导的氨基酸序列与其它植物CHS基因同源率在95%以上,含有CHS多基因家族的标签序列（GFGPG）、活性位点、底物结合口袋位点和环化反应口袋位点. 半定量RT-PCR分析苦荞花期FtCHS空间表达模型表明,其表达量未成熟种子＞叶＞茎＞花＞根＞成熟种子,与苦荞芦丁含量的分布基本一致,具有组织特异性.     

红霉素链霉菌聚酮合成酶基因eryA Ⅲ的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的:在大肠杆菌中异源表达红霉素链霉菌聚酮合成酶eryA Ⅲ基因.方法:构建表达载体pET-m28a,PCR扩增高GC含量长片段基因eryA Ⅲ及分子伴侣GroELS的基因,并插入该载体,每个基因都能够独立启动和终止表达;将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG进行诱导表达.结果:NdeⅠ、Hind Ⅲ分别酶切质粒pET-m28a/eryA Ⅲ-GroELS,琼脂糖凝胶电泳显示获得与预期大小相同的DNA片段;SDS-PAGE结果表明,重组大肠杆菌表达了由eryA Ⅲ编码的相对分子质量为348×103的蛋白;与GroELS共表达后,目的蛋白在上清中的表达量明显增加.结论:GroELS提高了eryA Ⅲ编码蛋白的可溶性,为红霉素合成通路在大肠杆菌中的重建奠定了基础.     

红霉素链霉菌聚酮合成酶基因eryAIII的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的:在大肠杆菌中异源表达红霉素链霉菌聚酮合成酶eryAIII基因。方法:构建表达载体pET-m28a,PCR扩增高GC含量长片段基因eryAIII及分子伴侣GroELS的基因,并插入该载体,每个基因都能够独立启动和终止表达;将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG进行诱导表达。结果:NdeⅠ、HindⅢ分别酶切质粒pET-m28a/eryAIII-GroELS,琼脂糖凝胶电泳显示获得与预期大小相同的DNA片段;SDS-PAGE结果表明,重组大肠杆菌表达了由eryAIII编码的相对分子质量为348×103的蛋白;与GroELS共表达后,目的蛋白在上清中的表达量明显增加。结论:GroELS提高了eryAIII编码蛋白的可溶性,为红霉素合成通路在大肠杆菌中的重建奠定了基础。     

絮凝酵母海藻糖合成酶基因TPS1启动子区的克隆和乙醇胁迫下启动子活性的变化

提高生物能源生产菌株对各种胁迫因素的耐受性对于提高生产过程的经济性和高效生产生物能源具有重要的意义。对酿酒酵母乙醇耐性的分子机制的研究,可揭示影响其耐受性的关键基因,并通过代谢工程操作定向提高酵母菌的乙醇耐受性,从而提高燃料乙醇的生产效率。海藻糖对酵母菌在多种环境胁迫下的细胞活性具有保护作用,但其对乙醇耐性分子机制的研究还不够深入。克隆了自絮凝酵母Saccharomyces cerevisiae flo的海藻糖-6-磷酸合成酶基因TPS1的启动子区域,利用pYES2.0载体骨架,构建了PTPS1启动绿色荧光蛋白EGFP标记基因的报告载体,并转化酿酒酵母ATCC4126。对酵母转化子在含有7%和10%乙醇的生长培养基中的EGFP的表达情况进行相对荧光定量分析,发现PTPS1活性在7%乙醇存在下受到强烈诱导。EGFP表达量对高温和高糖胁迫无明显差别,显示了TPS1启动子对乙醇浓度的特异响应。研究结果表明,絮凝酵母海藻糖的合成是对乙醇胁迫的保护性反应。     

叶酰多聚谷氨酸合成酶与肿瘤耐药

叶酰多聚谷氨酸合成酶(folyl-polyglutamate synthetase,FPGS)是近几年来研究比较多的肿瘤耐药靶酶之一。随着人们对其在基因组学和蛋白组学研究的逐渐深入,涉及FPGS(分胞浆型cFPGS和线粒体型mFPGS两种异构体)与肿瘤耐药的研究也越来越多。本文就FPGS结构、功能、生化特点及其与肿瘤耐药关系作一综述,并探讨其在临床的应用前景和意义。