我国发酵微生物农药的发展概况与趋势

简单叙述了生物农药的发展概况,再针对性的叙述了有代表性的发酵微生物农药：农用抗生素和苏云金杆菌的发展情况以及未来发展趋势。目前我国生物农药年产值约为18亿元,约占农药总产值的9％;其中发酵微生物农药年产值约为14亿元,占农药总产值的7％。预计发酵微生物农药将以7％-10％的速度增长壮大,5年后年产值将达到20亿元,可占到农药总产值的10％左右;其中农用抗生素类可占到农药总产值的9％。     

根癌农杆菌介导的哈茨木霉菌遗传转化的研究

利用根癌农杆菌EHA105进行了哈茨木霉Th-33的转化,在优化的转化条件下,EHA105对木霉菌的转化效率约45-100个转化子/106个孢子。本实验室利用该方法已建立了含4000多个转化子的木霉T-DNA插入突变体库。随机挑选24个转化子进行遗传稳定性分析,结果显示转化子经过5代无选择压力连续转接后都能在选择平板上正常生长;潮霉素抗性基因的PCR扩增和Southern blot杂交分析表明,木霉转化子含有该基因,Southern blot杂交进一步表明转化子多为单拷贝随机插入。该转化体系的改进将有利于木霉菌生防功能基因的克隆和作用机制的研究。     

一株防治香蕉枯萎病的短密木霉筛选及代谢物木霉素作用评价

由尖孢镰刀菌古巴专化型热带四号小种(Fusarium oxysporum f. sp. cubense tropical race4, FocTR4)引起的香蕉枯萎病(banana Fusarium wilt, BFW)是全世界范围内难以防治的真菌病害,给香蕉产业造成巨大的经济损失。本研究旨在筛选高效拮抗FocTR4的木霉生防菌株,并对其发酵代谢产物进行分离、提纯和鉴定,为香蕉枯萎病的高效生物防治提供重要生防菌株和活性化合物资源。从作物根际土壤中分离出木霉菌株,通过平板对峙培养、发酵液对病原菌孢子萌发及菌丝生长抑制,测试筛选出高效抑制FocTR4的生防木霉菌株;通过构建系统发育树明确生防菌株的分类地位;通过柱色谱法分离纯化菌株发酵液中活性成分,通过核磁共振波谱法(nuclear magnetic resonance spectroscopy, NMR)解析活性成分的结构;通过香蕉苗感病盆栽实验检测生防木霉菌株对香蕉枯萎病的防治效果。结果表明,本研究筛选到了1株拮抗FocTR4的菌株JSHA-CD-1003,平板对峙抑制率为60.6%;发酵液在24 h内能完全抑制FocTR4孢子萌发,7 d内对FocTR4菌丝生长的抑制率为52.6%;基于内转录间隔区(internal transcribed spacer, ITS)和tef1-α基因串联序列构建系统发育树,该菌株鉴定为短密木霉(Trichoderma brevicompactum),通过柱色谱法分离提纯和NMR鉴定单一活性化合物为木霉素(trichodermin),最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration, MIC)为25 μg/mL;盆栽生防实验表明,菌株JSHA-CD-1003发酵液对香蕉枯萎病的叶片黄化防治率为47.4%,球茎褐化防治率为52.0%。因此,JSHA-CD-1003通过产生木霉素有效抑制FocTR4孢子萌发和菌丝生长,对FocTR4引起的香蕉枯萎病具有良好的生物防治效果,是一株具有生防潜力的菌株。     

基因打靶与RNA干扰技术在丝状真菌基因功能组学研究中的应用

随着丝状真茵模式生物基因组测序工作的进行,其提供的大量未知功能的基因序列,为研究丝状真菌的基因功能开辟了新的方向,并已成为生命科学领域研究的热点.对基因功能研究中最新的两种方法--基因打靶和RNAi技术的原理、技术路线和特点以及应用情况进行综述.     

PCR方法筛选淡紫灰链霉菌海南变种基因组粘粒文库

以中生菌素产生菌淡紫灰链霉菌海南变种(Streptomyces lavendulae var.hainanensis)B-7菌株为材料,利用pOJ446作为载体构建了B-7菌株的基因组粘粒文库,文库效价达到4.21×106CFU/ml.随机挑取12个克隆提取质粒,经BamHI酶切电泳分析,插入片段大小约为30～40 kb,符合建库要求的理论值.利用建立的基于96深孔板PCR技术的文库筛选改良方法,成功快速地筛选到含有目标基因片段的阳性菌株.     

不吸水链霉菌ZB01 cyp107z基因的克隆及原核表达纯化

【目的】克隆不吸水链霉菌ZB01中的cyp107z基因,在E.coli中异源表达纯化,测定重组酶蛋白的酶动力学参数,为该基因的进一步研究奠定基础。【方法】根据cyp基因保守区序列设计引物,扩增不吸水链霉菌ZB01基因组中cyp107z基因的部分序列,通过染色体步移技术获取全长基因。利用pET28a表达载体构建该基因原核表达载体并于E.coli中诱导表达,以Ni-NTA亲和层析纯化表达出的重组蛋白。以阿维菌素为底物,构建重组蛋白体外催化体系,通过测定体系中NADPH的消耗,计算重组蛋白催化阿维菌素反应的酶动力学参数。【结果】从不吸水链霉菌ZB01基因组扩增出一条cyp107z基因同源基因,全长1290 bp,编码429个氨基酸残基,命名为cyp107z13,在E.coli中诱导表达了该重组酶蛋白,纯化后的重组酶蛋白催化阿维菌素的Km值为1.4μmol/L,Vmax为0.041μmol/min.mg,kcat为0.033 s-1。【结论】从不吸水链霉菌ZB01中克隆到cyp107z13基因,异源表达的CYP107Z13重组蛋白能够催化以阿维菌素为底物的氧化反应。     

高耐砷真菌的分离及其耐砷能力

从湖南石门县及郴州市重金属矿周边地区采集的6个砷污染土壤样品中,初步分离得到13株具有较强耐砷能力的真菌菌株,其中3株真菌的耐砷能力最强,经形态与分子鉴定分别为微紫青霉(Penicillin janthinellum)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)和棘孢木霉(Trichoderma asperellum).培养试验表明：微紫青霉、尖孢镰刀菌和棘孢木霉分别在30000 mg·L^-1、30000 mg·L^-1和20000 mg·L^-1的砷胁迫平板中表现出很好的菌落生长状况;在砷浓度分别为0～50、0～50和0～80 mg·L^-1的液态培养基中培养2 d后,尖孢镰刀菌、棘孢木霉和微紫青霉的生物量均随砷浓度增加而增加,且在相应最高浓度(50、50、80 mg·L^-1)下的生物量显著高于不加砷的对照.此外,高浓度砷对该3株真菌的产孢能力没有影响.     

真菌遗传转化系统的研究进展

真菌遗传转化是功能基因研究的重要方法,就真菌遗传转化系统的最新研究进展进行了综述,主要包括真菌遗传转化的方法、各种方法的优缺点、选择标记的种类、标记基因的分离方法以及转化系统的应用等。     

根癌农杆菌介导的木霉遗传转化及应用进展

木霉作为土传植物病原菌的生防真菌,研究其功能基因具有重要的意义。根癌农杆菌介导的遗传转化(ATMT)为木霉功能基因的研究提供了一个强有力的工具。对根癌农杆菌介导木霉遗传转化的机理、特点、方法及其在木霉中的应用进行了综述。     

中生菌素生物合成基因zpsA的克隆及序列分析

利用PCR技术,首次从淡紫灰链霉菌海南变种（Streptomyces Lavendulae var. hainanensis）的基因组克隆出了中生菌素生物合成基因簇中的负责β-赖氨酸活化的zpsA基因。根据国外已报道的诺尔丝菌素肽合成酶基因（npsA）和链丝菌素肽合成酶基因（sttA）的保守序列以及链霉菌基因密码子的偏爱性,设计简并引物;以中生菌素高产菌株UV-69的总DNA作为模板进行PCR,先后得到长度分别为O．284kb、0．611kb、0．34kb和0．371kb的PCR产物,经测序后拼接得到1．025kb的zpsA基因片段。在GenBank中的进行比对分析,发现ZasA与NpsA、SttA的功能相同,都具有非核糖体肽合成醇腺苷酸化域（A域）的功能。