网纹甜瓜发育果实糖分积累与蔗糖代谢参与酶的关系

随着网纹甜瓜果实的发育,果实中葡萄糖和果糖的含量增加,蔗糖的快速积累发生在果实发育的中后期,高蔗糖积累型果实中蔗糖积累速率明显快于低蔗糖积累型.蔗糖磷酸合成酶活性在果实发育的前期短暂下降, 而后稳步上升,在果实发育的中后期高蔗糖积累型果实中该酶的活性显著高于低蔗糖积累型果实;随着果实发育,蔗糖合成酶的分解活性降低而合成活性升高.酸性和中性转化酶在未成熟果实中活性较高,而在成熟果实中很低; 高蔗糖积累型果实中酸性转化酶活性显著低于同期低蔗糖积累型果实.合成蔗糖的酶活性小于分解蔗糖的酶活性时蔗糖几乎没有积累.根据这些结果推测,转化酶活性的下降、蔗糖磷酸合成酶活性的增加以及蔗糖合成酶分解活性的下降和合成活性的增加,是引起果实蔗糖积累的主要内在因子.     

一种插入116个氨基酸的亮氨酰—tRNA合成酶具有高酶活力

大肠杆菌亮氨酰 tRNA合成酶 (LeuRS)是第 1类氨基酰 tRNA合成酶 ,由 860个氨基酸残基组成 ,催化亮氨酸tRNA的亮氨酰化。研究发现 ,在它的CP1结构域内 3 68和 3 69间的肽键间插入 2 5 3～ 3 68的肽段 ,该插入变种的酶仍具有酶活力 ,取名为LeuRS C。由于这一插入变种的不稳定性 ,构建了His6 LeuRS C的表达质粒 ,用Ni NTA柱亲和层析的方法进行纯化。发现His6 LeuRS C虽然插入了 116个氨基酸残基 ,但仍具有全部的天然LeuRS的活力。测定了His6 LeuRS C的酶学动力学常数 ,比较了它与天然LeuRS的从CD光谱得到的二级结构和热稳定性     

耐热嗜酸古细菌Sulfolobus acidocaldarius谷氨酰胺合成酶的表达调控和性质研究

古细菌Sulfolobus acidocaldarius细胞内谷氨酰胺合成酶的表达量随着培养条件的改变有较大差异,RNA印迹表明,该差异是在mRNA水平受到调控.经DEAE-Sepharose和Sephacryl S-300两步分离酶蛋白,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和凝胶过滤测定分子质量,表明该酶为12个相同亚基组成,分子质量为630 ku的多聚体.该酶的最佳pH为7.3;对羟胺、谷氨酰胺、ADP和Mn2+的Km值分别为3.5 mmol/L、1.3 mmol/L、0.15 mmol/L和0.24 mmol/L;其γ-谷氨酰转移酶活性和生物合成酶活性的最佳温度均为90℃.Arrhenius曲线表明,γ-谷氨酰转移酶的活化能为47 kJ/(mol*K),生物合成酶的活化能分别为29 kJ/(mol*K)(40～75℃)和10 kJ/(mol*K)(55～90℃).对该酶的抑制剂研究发现,与其他来源的谷氨酰胺合成酶不同,甘氨酸、L-丙氨酸能明显抑制 S.acidocaldarius谷氨酰胺合成酶的活性,而常规的抑制剂如L-色氨酸、L-组氨酸、5′-AMP却没有抑制作用,甘氨酸、L-丙氨酸的抑制作用为竞争性抑制,推断该酶的活性调节与绝大多数革兰氏阳性菌一样不受腺甘酰化的影响.     

盐地碱蓬(Suaeda salsa)中SsINPS基因的分子克隆及表达特性分析

肌醇 1 磷酸 (I 1 P)合成酶 (EC5 .5 .1 .4,INPS)是肌醇生物合成中的关键酶 ,催化葡萄糖 6 磷酸 (G 6 P)到I 1 P的反应。从该实验室已构建的NaCl40 0mmol/L处理的盐地碱蓬 (Suaedasal sa)cDNA文库中克隆了肌醇 1 磷酸合成酶的全长cDNA (S .salsamyo inositol 1 phosphatesynthase,SsINPS) ,基因注册号为AF43 3 879。SsINPS全长约 1 986bp ,含有开放式阅读框架 1 5 3 0bp ,3′和 5′的非翻译区分别为 1 3 9bp和 3 1 7bp ;推导的氨基酸序列全长 5 1 0个氨基酸残基 ,分子量约为 5 6 .7kD ,pI值为 5 .3 5。BLAST同源性分析表明 ,该cDNA与已报告的冰叶日中花 (Mesembryanthemumcrys tallinum)的INPS基因同源性最高 ,其中 ,核苷酸水平的同源性为 91 % ,氨基酸水平上的同源性为84%。以SsINPS全长cDNA为探针进行的South ern杂交结果表明 ,SsINPS基因在盐地碱蓬基因组中只有一个拷贝 ;Northern结果表明 ,在盐处理(40 0mmol/L的NaCl)下 ,SsINPS在叶中的表达量有显著的增加。从而说明SsINPS在盐胁迫下是上升调节的     

对水稻4号染色体上一个编码二氢黄酮醇还原酶类似蛋白基因簇的结构和进化分析

通过对水稻 4号染色体一段 32 3kb的序列测定和分析 ,在其中 56kb的区域内发现了一个由 7个编码二氢黄酮醇还原酶 (DFR)类似蛋白基因组成的基因簇。这 7个基因在基因簇中串联排列 ,每个基因都由 6个外显子和 5个内含子组成。这 7个基因的预测蛋白质序列都和DFR以及BANYULS蛋白序列类似。DFR和BANYULS都是植物次生代谢类黄酮醇生物合成途径中的结构基因 ,它们的缺失或突变都会造成植物花色素合成代谢的不正常。RT PCR实验证明这 7个基因在水稻的 5个组织中表达不同。文中讨论了这 7个基因的结构和功能特性以及它们的进化关系。     

N端的改变对大肠杆菌精氨酰—tRNA合成酶的影响

得到了缺失Asn2 的大肠杆菌 (E .coli)精氨酰 tRNA合成酶 (ArgRS)的变种和在其N端添加酵母ArgRS的N端 2 3个氨基酸残基的嵌合变种。它们的基因在大肠杆菌中表达时 ,可能由于蛋白质误折叠 ,大部分产生了包涵体。与天然酶相比 ,缺失变种保留了全部的氨基酸活化活力 ,但氨基酰化活力下降了 2 6 % ;嵌合变种的以上两种活力下降了 90 %以上 ,不能氨基酰化酵母tRNAArg。缺失Asn2 和Ile3 的变种在E .coli中虽被表达 ,但不稳定。与天然酶相比 ,嵌合变种的荧光光谱的最大发射波长向长波移动 ,强度减小。表明变种酶的构象和天然酶不同 ,色氨酸更暴露。用远紫外CD光谱预测变种酶的二级结构表明 ,嵌合酶的α螺旋更少 ,β折叠更多 ,无规卷曲稍多。E .coliArgRS的N端结构域对活力和正确折叠是重要的     

高等植物中与蔗糖代谢相关的酶

就近年来高等植物转化酶,蔗糖磷酸合成酶和蔗糖合成酶等3种与蔗糖代谢相关酶的作用,基因的克隆以及转基因植株的表现作了述评。     

鞘磷脂合成酶的提取和检测

在20℃条件下,采用相对饱和度为80％的（NH4）2SO4一步盐析并经低温冷冻干燥12h得到鞘磷脂合成酶粗酶粉后,采用体外酶促反应并结合HPLC法检测鞘磷脂合成酶的含量。     

RNA干扰技术及其应用

RNA干扰（RNAi)是利用具有同源性的双链RNA诱发序列特异的转录后基因沉默的现象。它可以通过抑制蛋白表达模拟基因敲除技术,从利用体外合成双链RNA到通过质粒稳定表达小型干扰RNA诱发RNA干扰现象,这项技术被不断完善,并被广泛的应用,尽管RNAi的作用机制仍不清楚,但实验证实在RNA干扰过程中,外源的双链RNA在体内会被切割成小片段,新的双链RNA被合成,从而RNAi的作用机制假说正被逐步修正,由于RNAi技术的高效性和特异性,它已经成为基因功能研究的一种新方法。     

大肠杆菌CMP-唾液酸合成酶最小活性域的研究

比较大肠杆菌与脑膜炎奈瑟氏球菌的CMP-唾液酸合成酶的氨基酸序列,发现大肠杆菌CMP-唾液酸合成酶的保守区域主要位于N-端,其C-末端似乎对其催化活性没有作用。通过PCR方法,对大肠杆菌CMP唾液酸合成酶的C-末端进行了一系列截短,将得到的产物连接至表达载体pET-15b中,在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中表达。经IPTG诱导,发现从C-末端截去189个氨基酸酶仍有催化活性,说明大肠杆菌CMP唾液酸合成酶的最小活性域主要集中在N-末端的229个氨基酸。有催化活性的C-端缺失突变合成酶的比活、最适pH及热稳定性发生变化,提示被截去的C-端氨基酸残基虽不直接参与构成酶的催化活性中心,但可影响催化活性域的构象,从而对酶的催化活性与稳定性产生影响。 