抗原抗体复合物型治疗性疫苗(乙克)临床研究中患者血清乙型肝炎病毒表面抗原下降的分析与启示

近年来全球慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)防治指南提出了“功能性治愈”(functional cure)的概念,即患者经过治疗达到血清乙型肝炎病毒表面抗原(hepatitis B virus surface antigen,HBsAg)消失,但现有抗病毒治疗很难实现这一目标。本研究对既往临床试验中经抗原抗体复合物型治疗性疫苗(乙克)治疗后的CHB患者HBsAg下降情况进行了归纳分析,结果显示,经乙克治疗随访后达到乙型肝炎e抗原(hepatitis B e antigen,HBeAg)血清学转换者的HBsAg下降高达0.95log₁₀IU/mL,显著高于未达到HBeAg血清学转换者的0.32log₁₀IU/mL(P<0.01),而经氢氧化铝佐剂治疗随访后发生HBeAg血清学转换(0.49log₁₀IU/mL)者与未发生HBeAg血清学转换者(0.36log₁₀IU/mL)之间HBsAg下降无统计学差异。乙克组治疗过程中,丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)骤升(ALT flare)在HBsAg下降>1.0log₁₀IU/mL者中较多见,氢氧化铝组未观察到此现象。回归分析显示,乙克治疗后HBsAg下降的影响因素有患者出现HBeAg血清学转换、感染的HBV为B基因型、治疗过程中ALT出现10倍增高,以及基线血清HBsAg为高水平。结果提示,乙克诱导的特异性免疫对降低CHB患者血清HBsAg水平有一定效果,采用“抗病毒药物治疗＋针对HBsAg的中和性抗体被动免疫＋乙克主动免疫”的“三明治”治疗策略可能会提高“功能性治愈”率。     

家蝇Phormicin A多克隆抗体的制备及效价检测

家蝇Phormicin作为防御素家族的成员,是一类具有广普抗菌活性的抗菌肽.本研究采用原核表达法表达并纯化获得了家蝇PhormicinA蛋白.将家蝇Phormicin A原核表达蛋白与完全佐剂和不完全佐剂乳化混匀,先后免疫新西兰白兔获得其多克隆抗体.通过原核表达蛋白中和吸附实验,以及Western blot实验验证了抗体的特异性.进一步用金黄色葡萄球菌刺激家蝇三龄幼虫样品,进行内源性验证并测定抗体的效价.结果 显示,该多克隆抗体既可以识别家蝇Phormicin A原核表达蛋白,也可以识别金黄色葡萄球菌刺激家蝇三龄幼虫产生的内源性Phormicin A蛋白.本研究为进一步探索Phormicin在家蝇天然免疫和防御中的机制等后续工作打下基础.     

HIV-1感染长期不进展者的B细胞谱系研究进展

高效抗反转录病毒治疗(highly active anti-retroviral therapy, HAART)在人类免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus type 1, HIV-1)感染方面取得了显著成效,但仍无法治愈艾滋病。研发出能够诱导中和多种HIV-1毒株能力的广谱中和抗体HIV-1疫苗,已成为防治HIV-1感染的重要目标。HIV-1感染长期不进展者是广谱中和抗体的主要提供者,阐明长期不进展者的B细胞谱系特征,将为广谱中和抗体成熟的相关研究奠定重要基础,为HIV-1疫苗研发提供新思路。现就HIV-1感染长期不进展者的B细胞谱系研究进展作一概述。     

基于新型冠状病毒S蛋白结构及入胞机制的抗体与药物研发

新型冠状病毒肺炎,世界卫生组织命名为“2019冠状病毒病”（corona virus disease 2019, COVID-19）,是一种由2019新型冠状病毒（2019 nCov）感染导致的肺炎。目前新冠肺炎在全球广泛流行,且疫情尚未得到全部控制。由于新型冠状病毒表面的刺突蛋白（spike protein,S）介导病毒与细胞膜受体结合并参与入胞过程,S蛋白在病毒的传播过程中发挥着重要作用。针对S蛋白的研究不仅可以解析病毒相关蛋白质结构与功能,阐释其入胞机制,同时也为新冠肺炎的预防、诊断与治疗提供相关信息,有着重要的应用价值。S蛋白与特异性受体--血管紧张素酶II（angiotensin converting enzyme II, ACE2）结合,相较于SARS病毒,新型冠状病毒S蛋白的RBD区域（receptor binding domain）与ACE2亲和力更高,但其S蛋白与ACE2结合能力整体上弱于SARS病毒。S蛋白结合ACE2受体 介导的新型冠状病毒入胞机制包括胞吞和非胞吞途径。丝氨酸蛋白酶2（transmembrane protease serine 2, TMPRSS2）、溶酶体组织蛋白酶（lysosomal cathepsin）和Furin蛋白酶可切割S蛋白S1和S2亚基间的酶切位点,促进病毒和靶膜的融合。基于S蛋白的结构,本文从抗体的结合位点、来源与类型等方面对靶向新型冠状病毒S蛋白的抗体进行了比较分析,对相关药物作用机制与进展进行了综述。虽然靶向冠状病毒S蛋白的抗体和药物特异性高,治疗效果较好,但部分试剂的作用机制、安全性、适用性和稳定性等性质仍未研究透彻,需要严格评估,因此其研发与应用也存在着一定挑战。     

草鱼促性腺激素基因的原核表达及多克隆抗体的制备

选用原核表达载体pGEX-4T-1,分别插入草鱼GTH和FSHβ的cDNA序列,构建成N端含有GST融合蛋白标签的表达质粒,分别转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下表达出2个融合蛋白,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳显示重组融合蛋白GST-GTHα和GST-FSHβ的相对分子质量大约为35、38 kD.用抗GST标签的单克隆抗体分别对2个表达蛋白进行Western blot鉴定,结果显示重组蛋白表达正确.利用制备型SDS-PAGE纯化回收的蛋白并免疫新西兰大白兔,分别制备了抗GTH和抗FSHβ的具有较高效价的多克隆抗体.该结果为纯化天然GTH蛋白提供了有效的检测手段,也为进一步制备GTH单克隆抗体奠定了基础.     

斑马鱼Fbxl5基因多克隆抗体的制备与检测

Fbxl5为F-box基因家族的一员,目前研究发现其与心脏的发育有关。为了在斑马鱼模型中进一步研究该基因的功能,有必要制备其多克隆抗体。通过桥式PCR扩增出亲水性和特异性均好的斑马鱼Fbxl5基因片段,将其克隆入表达载体pET-28a,转化至大肠杆菌Rosseta中。用IPTG诱导Fbxl5重组质粒得到His-Fbxl5的融合蛋白。这个融合蛋白用Ni-IDA凝胶柱亲和纯化,将纯化的His-Fbxl5融合蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。使用Western Blot检测,获得了Fbxl5原核表达重组融合蛋白及高效价的特异性兔抗Fbxl5多克隆抗体。随后检测了Fbxl5在斑马鱼胚胎和成体组织中蛋白的表达,通过基因芯片分析在Fbxl5-MO和Std胚胎样品的mRNA含量差异.所得结果显示获得了较高效价和特异性好的斑马鱼Fbxl5多克隆抗体,为Fbxl5功能的进一步研究奠定了基础。     

定量检测 IL-2-HSA 融合蛋白双抗体夹心 ELISA 法的建立

目的:通过抗体配对方法,建立能高特异、高灵敏地定量检测食蟹猴体内 IL-2-HSA 融合蛋白浓度的双抗体夹心 ELISA 法.方法:以 IL-2单克隆抗体为包被抗体、IL-2-HSA 融合蛋白为夹心抗、生物素标记的 HSA 为检测抗体,一抗和二抗的工作浓度分别为8μg/mL 和1∶5000,HRP 标记的亲和素为1∶200.结果:IL-2-HSA 融合蛋白标准品的曲线范围为3.9~250 ng/mL,最低检测限为3.9 ng/mL,与 IL-2、HSA、GLP-1/HSA 和 CD20单抗均无交叉反应,方法的回收率为98.9%~101.5%,批内和批间准确度分别为96.1%~98.3%和93.9%~105.4%.结论:本方法符合新生物制品临床前药代动力学研究指导则的要求,可用 IL-2-HSA 融合蛋白在临床前药代动力学试验的定量检测.     

蛋白芯片法在抗核抗体检测中的临床应用

目的：应用蛋白芯片法与欧蒙斑点法检测血清抗核抗体,并对其结果进行比较分析。方法：收集95例血清样本,其中45例确诊为自身免疫性疾病,阴性50例,同时采用蛋白芯片法和欧盟斑点法检测其抗核抗体（SSA、SSB、Sm、RNP、Scl—70、Jo-1、CENPB）,并对结果进行对比分析。结果：45例确诊病例中,蛋白芯片法阳性44份,欧蒙斑点法阳性41份,敏感度分别为97．78％和91．11％,特异度分别为98．95％和95．79％;按卡方检验进行结果统计,x^2=1．75,P〉0．05,差异无统计学意义。结论：蛋白芯片可用于临床检测自身免疫性疾病、治疗监测、疗效评估和预后判断。     

自噬相关基因LC3-I的基因表达及单克隆抗体的制备

目的：通过克隆LC3．I基因,体外原核表达LC3-I蛋白后制备抗LC3单克隆抗体,作为自噬研究中的标记分子检测自噬的发生和发展过程。方法：RT．PCR方法从RAW264．7细胞基因组中克隆LC3基因,亚克隆至pQE80L原核表达载体后转化E．cobDH5a进行诱导表达,SDS—PAGE电泳及Westemblot鉴定表达蛋白。蛋白纯化后免疫BALB／c小鼠。采用淋巴细胞杂交瘤技术,制备分泌抗LC3．I杂交瘤细胞株,体内诱生腹水制备mAb,间接ELISA法测定其效价,辛酸一硫酸铵沉淀法及亲和层析法纯化mAb。结果：成功克隆了LC3一I基因,并对其在E．coilDH5a进行诱导表达,SDS-PAGE分析表明在相对分子量Mr为20×10^3有特异条带,Westernblot验证表达产物具有一定的生物学活性。建立了3株稳定分泌特异性抗LC3-ImAb的杂交瘤细胞株,诱导产生的腹水获得的抗体效价在10^5-10^7之间,结论：在E．coli中对LC3-I进行表达,并制备特异性较强抗LC3-I蛋白的单克隆抗体。为自噬研究提供了良好的标记分子,可对自噬形成和发展进行有效的检测。     

七鳃鳗Lja-SHP2分子鉴定、重组表达及免疫学研究

高等脊椎动物的蛋白酪氨酸磷酸酶SHP2(SH2 domain-containing protein-tyrosine phosphatase-2)由ptpn11基因编码,催化酪氨酸残基去磷酸化,与其他能催化酪氨酸磷酸化的蛋白酪氨酸激酶共同调节机体内多种信号通路的信号传导。以往研究表明,SHP2在高等脊椎动物T细胞和B细胞的激活与信号转导过程中起着重要作用。为了研究无颌类脊椎动物日本七鳃鳗(Lampetra japonica)中与SHP2同源的分子——Lja-SHP2在免疫应答反应中的作用,本研究通过PCR扩增获取其Lja-SHP2开放阅读框序列,并构建到原核表达载体pET-32a中,成功在大肠杆菌中实现重组蛋白表达并制备了其兔源多克隆抗体。用混合菌免疫刺激日本七鳃鳗后,通过实时荧光定量PCR和免疫印迹方法检测了Lja-SHP2在日本七鳃鳗免疫相关组织中mRNA和蛋白水平表达谱。结果显示,混合菌免疫刺激后,Lja-SHP2 mRNA和蛋白表达在外周血白细胞和髓样小体中无显著变化,而在鳃组织中显著性上调(P<0.05),说明Lja-SHP2在混合菌刺激后主要参与了鳃组织的免疫应答反应。为了进一步探究Lja-SHP2与淋巴细胞亚群免疫应答反应的相关性,本研究分别使用B细胞有丝分裂原脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)和T细胞的有丝分裂原植物凝集素(phytohemagglutinin,PHA)免疫刺激日本七鳃鳗。经LPS免疫刺激后,与对照组相比,白细胞中Lja-SHP2蛋白表达显著上调,鳃组织和髓样小体没有显著性差异表达;但经PHA免疫刺激后,与对照组相比,白细胞、鳃组织和髓样小体3种组织中Lja-SHP2均有上调,尤其在白细胞中上调最为显著,大约是对照组的2.5倍,说明Lja-SHP2参与了日本七鳃鳗由PHA介导的免疫应答反应。由于PHA能刺激日本七鳃鳗鳃组织中VLRA+淋巴细胞的活化,这表明Lja-SHP2可能参与了PHA介导的VLRA+淋巴细胞亚群的免疫应答反应。上述研究结果为进一步探索Lja-SHP2在七鳃鳗免疫应答过程中的功能奠定了基础,也为揭示SHP2分子家族的系统发生及探索高等脊椎动物适应性免疫系统的早期发生及其进化历程提供一定的线索。