二点委夜蛾非典型嗅觉受体AlepOrco的基因克隆、原核表达及多克隆抗体制备

【目的】非典型嗅觉受体(olfactory receptor co-receptor, Orco)与典型嗅觉受体共同形成离子通道,在昆虫嗅觉识别中具有至关重要的作用。本研究旨在克隆和表达二点委夜蛾Athetis lepigone Orco基因,明确其分子特性,为进一步研究该基因在二点委夜蛾中的功能奠定基础。【方法】将二点委夜蛾雌雄成虫触角转录组数据建立本地数据库,通过生物信息学分析获得二点委夜蛾Orco同源基因AlepOrco;利用RT-PCR方法克隆二点委夜蛾AlepOrco基因全长,并在pGEX-6P-1/BL21(DE3)系统中进行了该基因开放阅读框(ORF)的原核表达,制备多克隆抗体,用Western blot检测抗体特异性;利用qPCR技术检测该基因在二点委夜蛾雌雄成虫不同组织(喙、触角、去除触角和喙的头、胸、腹、足和翅)中的表达谱。【结果】获得了二点委夜蛾AlepOrco的cDNA(GenBank登录号:MN583125)全长序列,开放阅读框长1 422 bp,编码473个氨基酸,序列中有7个跨膜结构区,预测等电点为8.59,分子量为53.40 kD。SDS-PAGE和Western blot分析结果表明AlepOrco能够在大肠杆菌Escherichia coli中高效表达。利用制备的多克隆抗体对二点委夜蛾AlepOrco进行Western blot检测,其能够特异识别成虫触角中AlepOrco蛋白。qPCR结果表明,AlepOrco在二点委夜蛾雌雄成虫不同组织间具有相似的表达模式,都是在触角中的相对表达量最大,在翅中的表达量最小。【结论】克隆并原核表达了二点委夜蛾非典型嗅觉受体基因AlepOrco,制备的多克隆抗体能够特异识别二点委夜蛾成虫触角中的AlepOrco。结果为深入了解二点委夜蛾AlepOrco基因的结构和功能奠定了基础。     

单克隆抗体在植物研究中的应用

单克隆抗体是现代生命科学研究的重要工具。随着分子生物学的发展,单克隆抗体在植物研究中发挥着越来越重要的作用。本文综述了单克隆抗体在蛋白表达、蛋白定位、蛋白相互作用、植物成分的定性与定量、植物成分纯化、植物病害检测、标签抗体等方面研究中的应用。     

褐飞虱flightin的原核表达及其差异表达检测

flightin最早发现于果蝇Drosophila melanogaster的间接飞行肌中,并且定位于粗肌丝。这种蛋白对维持肌节的结构和功能起到了重要的作用,但其在具有长短翅型分化的褐飞虱Nilaparvata lugens Stl的不同翅型间差异并不清楚。本研究以长翅型雌虫褐飞虱cDNA为模板,通过PCR扩增得到褐飞虱flightin基因ORF全长,将其连接到表达载体pGEX-6P-1中以与谷胱甘肽S-转移酶(GST)融合表达。将表达载体转入大肠杆菌表达株Rosseta,在不同温度、不同浓度IPTG的条件下诱导表达flightin,得到了最优表达条件,获得了高水平可溶性表达。在用GST抗体进行Western blotting验证GST-flightin融合重组蛋白表达的正确性后,我们通过GST柱纯化了的GST-flightin,进而用纯化后的蛋白免疫新西兰兔制备了高特异性的多克隆抗体。最后,我们用制备的多克隆抗体检测了长、短翅型雌成虫和不同发育阶段的褐飞虱体内flightin的表达差异。结果显示,flightin仅在长翅型成虫中表达,在短翅型雌成虫中未检测到其明显表达,而且flightin只在成虫期表达。本研究为进一步研究褐飞虱的flightin与其它蛋白互作、翅肌发育和翅型分化打下了基础。     

苦荞黄酮-3-羟化酶截短体的原核表达与多克隆抗体制备

为了制备苦荞黄酮-3-羟化酶的多克隆抗体,该研究以苦荞种子灌浆期cDNA文库中获得的苦荞黄酮-3-羟化酶基因截短体(truncated Flavanone-3-hydroxylase,TrF3 H)序列为基础,采用PCR扩增F3 H的截短序列编码区(TrF3 H),构建了原核表达载体pET47b-TrF3 H,并转化入大肠杆菌Rosetta(DE3)plysS中进行诱导表达,将经钴离子螯合层析柱纯化后的目的蛋白切胶回收后制备了高效价的多克隆抗体。结果表明:pET47b-TrF3 H在大肠杆菌Rosetta(DE3)plysS中以包涵体的形式高效表达。蛋白质印迹显示,制备的多克隆抗体能特异识别其对应的抗原,天然的黄酮-3-羟化酶蛋白在苦荞的未成熟种子中大量表达。原核表达体系的建立和多克隆抗体的制备为进一步探讨F3H在苦荞中功能奠定了基础。     

贯叶连翘提取物对小鼠免疫性心肌炎的作用

目的:探讨贯叶连翘提取物对小鼠免疫性心肌炎的治疗作用。方法:猪心肌球蛋白免疫BALB/C小鼠,建立免疫性心肌炎模型。结果:贯叶连翘提取物能抑制小鼠脾脏组织,降低外周血T淋巴细胞CD4/CD8比例和血清肌球蛋白自身抗体滴度,减轻心肌内淋巴细胞浸润。结论:贯叶连翘提取物对小鼠免疫性心肌炎有治疗作用。     

两步串联层析法纯化抗TNF-α单克隆抗体北大核心CSCD

旨在建立从重组CHO细胞发酵培养液中纯化抗TNF-α单克隆抗体的两步串联层析法。将含有抗TNF-α单克隆抗体的料液经两次离心、一步过滤的预处理后,用protein A填料捕获,阳离子填料Sourec30精细纯化。精细纯化过程中利用Do E的方法,采用CCF(Central composite face)设计,探讨了洗脱p H值及盐浓度对纯化的影响。纯化后的抗TNF-α单克隆抗体经HPLC以及毛细管电泳,检测其浓度、纯度以及多聚体含量。结果显示,亲和层析的最佳洗脱条件为p H4.0。通过DOE优化,为达到质量目标(回收率90%以上,纯度97%以上,多聚体0.3%),筛选出最佳洗脱范围为0.05-0.13 mol/L Na Cl以及p H5.7-6.0,选定p H6.0与0.10mol/L Na Cl作为Source洗脱条件,此时回收率94.3%,纯度97.3%,多聚体0.3%,其质量与参比制剂接近。     

抗环瓜氨酸肽抗体联合类风湿因子在检测类风湿关节炎中的临床价值

目的：探讨抗环瓜氨酸肽抗体（抗CCP抗体）以及类风湿因子（RV）检测对类风湿关节炎（RA）诊断的意义。方法：采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测355份人血清的抗CCP抗体,同时采用使用贝克曼库尔特Image800双光镜免疫浊度分析仪定量监测类风湿因子（RF）,其中包括门诊及住院RA患者135例,非RA组170例,正常对照组来自本院的健康体检人员50例。结果：抗-CCP检测在RA组与非RA组（和正常对照组）之间的检测结果有统计学差异（P〈0．05）。RF检测在RA组与非RA组（和正常对照组）之间的检测结果有统计学差异（P〈0．05）。在135例RA病人中,抗CCP抗体的阻性率为70．4％,在非RA病人中的阳性率为3．5％,抗CCP抗体对RA的敏感性和特异性分别为70．4％、96．5％。RF的阳性率为63．7％,在非RA病人中的阳性率为14．1％,RF对RA的敏感性和特异性分别为63．7％、81．1％。联合应用抗CCP抗体与RF进行诊断,串联时敏感性为59．3％,特异性为97．1％。并联时敏感性为74．8％,特异性为85.3％。结论：抗CCP抗体和RF对RA具有较好的敏感性和很高的特异性,二者联合检测可提高对RA早期诊断的准确性。     

EV71结构蛋白VP0的表达及抗体的制备

目的:原核表达EV71结构蛋白VP0(VP2+VP4)并制备其多克隆抗体.方法:以肠道病毒71型(EV71)全基因组为模板,设计引物扩增出目的片段VP0,将其克隆至表达载体pET-30a(+),并转化大肠杆菌TG1,筛选出阳性克隆后进行测序.将重组表达载体pET-30a (+)-VP0转入大肠杆菌表达菌株Rosetta中.该重组菌经过IPTG诱导表达并通过SDS-PAGE电泳和Western Blot验证后,有与预期分子量大小一致的蛋白条带,并且主要以包涵体的形式存在.包涵体用6 mol/L盐酸胍溶解,经过Ni-NTA亲和层析法纯化,获得了纯度较高的目的蛋白.将纯化的蛋白免疫新西兰大白兔制备了VP0多克隆抗体,并对该抗体进行了细胞免疫荧光分析.结果:经过大肠杆菌重组表达并纯化得到了纯度较高的VP0蛋白,制备的多克隆抗体经过细胞免疫荧光的验证表明反应性良好.结论:成功地表达VP0蛋白并制备了其多克隆抗体,有利于EV71病毒的检测及下一步对其疫苗的研究.     

抗体药物现状及发展趋势

治疗性抗体作为一种具有独特优势的生物靶向治疗药物,已成为目前全球药物研发的热点。截止到2013年2月,已有34个治疗性抗体获得美国FDA批准上市,用于各种疾病的治疗。据统计,目前有多达350余种抗体产品正处于临床试验阶段,其中29个已进入III期临床试验。开发抗体新靶点和新适应证,研究和设计更为安全有效的新型抗体分子及抗体组合疗法,寻找生物标记指导抗体对病人的有效治疗,是当前和今后一段时期内该领域发展的主要方向。本文将综述国际抗体药物研发现状和发展趋势,并对国内抗体药物现状及发展策略予以简要陈述。     

治疗性抗体专利分析

治疗性抗体药物是生物制药领域最受瞩目的发展方向和研究热点,单克隆抗体又是该领域的重中之重。治疗性抗体的核心技术目前主要集中在少数发达国家（如美国、加拿大、日本等）和大型制药公司（如罗氏公司、拜耳公司等）,着重关注癌症、免疫性疾病等的治疗。我国拥有的完全自主知识产权的抗体产品少、产业化规模小,但在政府的大力支持下,具有强劲的发展潜力和广阔的发展空间。