重组小鼠IL-38蛋白制备及其生物学活性分析

制备小鼠IL-38蛋白,并检验其生物学活性。对IL-38的基因进行密码子优化并化学合成优化后的基因,将其插入原核表达载体pET28a(+),构建pET28a-IL-38质粒,转化至大肠埃希菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,镍亲和层析法纯化制备IL-38蛋白;分别用IL-36γ和IL-38干预小鼠肠系膜淋巴结(mesenteric lymph node,MLN)细胞,ELISA检测各组Th1细胞因子的分泌水平。经SDS-PAGE分析获得纯度高达95%的IL-38蛋白。相对于对照组,IL-38处理组Th1细胞因子分泌水平明显降低(P0.05)。成功制备小鼠IL-38蛋白,证实了IL-38对IL-36γ刺激的MLN细胞炎性反应具有负向调控作用,为进一步研究IL-38在炎症性疾病中的免疫调节功能提供参考。     

柯萨奇病毒A5病毒样颗粒的制备、纯化和鉴定

目的构建柯萨奇病毒A5(coxsackievirus A5, CV-A5)病毒样颗粒(virus-like particles, VLPs),并对其进行纯化和鉴定。方法①将CV-A5 P1和3CD基因序列根据昆虫细胞密码子偏好性,对CV-A5-3487R4/CHN XY/2017株基因进行优化并合成,然后分别克隆至供体质粒pFastBacDual的多角体蛋白启动子(polyhedrin promotor, pPh)和pPl0启动子后,构建pFastBacDual-Pl/3CD重组质粒;②重组质粒转化到大肠杆菌(Escherichia coli,)DH10 Bac~(TM)中,转座形成重组杆状病毒质粒(baculovirus plasmid, bacmid);③再将重组bacmid转染Sf9细胞,获得重组杆状病毒并表达CV-A5结构蛋白、组装VLPs。应用限制性酶切、PCR扩增、免疫荧光(immuno-fluorescence assay, IFA)技术对CV-A5 VLPs的蛋白进行鉴定;④再利用蔗糖垫底离心和氯化铯(CsCl)密度梯度离心的方法纯化CV-A5 VLPs,并用SDS-PAGE、Western Blot和透射电镜法进一步检测CV-A5 VLPs的浓度和纯度及颗粒形态。结果 pFastBacDual-P1/3CD重组质粒经限制性双酶切、重组Bacmid PCR鉴定、rCV-A5 VLs PCR鉴定结果显示,均在预期目标处有清晰条带。利用IFA检测重组病毒rBacCV-A5-P1/3CD蛋白,结果可见明显荧光。rCV-A5 VLPs经SDS-PAGE检测到VP0为39 000、VP1为34 000和VP3为27 000;Western Blot检测也可见相应特异性条带。利用透射电镜观察纯化rCV-A5 VLPs,可见直径为23～33 nm的颗粒,形态和大小均与CV-A5一致。结论成功构建了rBacCVA5-P1/3CD重组病毒,并在sf9细胞内成功表达了CV-A5 VLPs,为今后CV-A5 VLPs疫苗的研发奠定了基础。     

恶性疟原虫重组pfs230蛋白在不同表达系统中表达的研究进展

恶性疟原虫pfs230蛋白是恶性疟疾传播阻断疫苗主要的抗原之一,可影响雌雄配子的受精过程,这种疫苗对阻断恶性疟疾的传播至关重要。鉴于pfs230蛋白分子较大,以及独特的富含半胱氨酸的结构特征,体内表达有活性的全长重组pfs230蛋白存在困难。现就pfs230蛋白的生物学特征和恶性疟疾传播阻断型疫苗的活性评价方法,用大肠埃希菌、小麦胚芽无细胞系统、毕赤酵母和昆虫细胞中表达pfs230蛋白的进展,以及在不同表达系统中优化恶性疟疾pfs230蛋白表达的策略作一概述。     

三个棉蚜谷胱甘肽-S-转移酶(GST)基因克隆及在不同寄主专化型中的表达分析

【目的】明确棉蚜Aphis gossypii Glover体内3个高表达谷胱甘肽-S-转移酶(GST)基因不同发育阶段的表达谱,并比较它们在不同寄主专化型棉蚜中的表达差异。【方法】从棉蚜的伏蚜和苗蚜转录组数据库中挑选GSTs并克隆得到全长cDNA序列,使用qRT-PCR分析这些基因在不同寄主专化型棉蚜不同龄期中的相对表达量。【结果】克隆到3个高表达的GSTs基因,分别命名为AgoGST-s1(GenBank登录号:MN688789)、AgoGST-d1(GenBank登录号:MN688790)、AgoGST-d2(GenBank登录号:MN688791)。这3个基因在不同龄期均表达,不同发育阶段的表达谱基本一致,表达量呈现从低到高的变化趋势。AgoGST-s1基因在各个发育阶段相对表达量的变化幅度较小,而AgoGST-d1、AgoGST-d2的变化幅度较大。对比两种寄主专化型棉蚜相同龄期时的表达情况发现,黄瓜型棉蚜中GSTs基因的表达量在大部分龄期都高于棉花型棉蚜。【结论】AgoGST-s1、AgoGST-d1、AgoGST-d2基因表达量伴随棉蚜生长发育变化趋势明显,在不同寄主专化型棉蚜体内的表达量存在差异,可能与棉蚜对寄主植物的适应性有关。     

米曲霉异源蛋白表达系统研究进展及展望

米曲霉作为一种重要的工业微生物,在异源蛋白表达方面已有广泛应用,受限于被表达蛋白的修饰及分泌过程,目前实际生产使用的基因供体主要局限于其他真菌,尤其是丝状真菌。当外源基因来源于植物、昆虫和哺乳动物时,米曲霉所生产的异源蛋白产量及生物活性往往不尽如人意。本文综述了米曲霉作为宿主表达异源蛋白的研究进展,包括其现有的遗传操作手段及异源表达方面的应用及探索,重点介绍了应用过程中面临的挑战和解决策略,另外,对米曲霉表达异源蛋白的应用前景及发展方向进行了展望。     

YPS1/YPS2失活改进酿酒酵母An-α菌株β-葡萄糖苷酶分泌表达

[背景] 工业酵母菌株的蛋白质表达通常存在表达量低、分泌效率低的问题。[目的] 考察失活Yapsin蛋白酶Yps1p和Yps2p对β-葡萄糖苷酶在酿酒酵母An-α菌株中表达的影响。[方法] 利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术,首先构建得到未折叠蛋白响应（Unfolded Protein Response,UPR）指示菌株An-α（leu2：：UPRE-lacZ）即An-αL,然后分别失活其YPS1和YPS2基因,导入以YEplac195为载体的β-葡萄糖苷酶表达质粒（简称BG）,进行生长和酶活分析评价。[结果] 菌株An-αL的YPS1和YPS2基因失活对其在酵母浸出粉胨葡萄糖（Yeast Extract Peptone Dextrose,YPD）培养基中的生长未造成明显的不利影响;导入质粒BG后将在酵母浸出粉胨纤维二糖（Yeast Extract Peptone Cellobiose,YPC）培养基中生长的最大OD₆₀₀分别提高了21.9%和7.4%;最大总酶活值为0.087 5和0.068 6 U/（mL·OD₆₀₀）,是对照菌株相应值的2.268倍和1.778倍;分泌比例提高了19.4%和22.2%;β-葡萄糖苷酶表达水平与β-半乳糖苷酶酶活水平所代表的UPR信号响应值之间呈现良好的相关性。[结论] YPS1和YPS2基因失活有助于改进酿酒酵母An-α菌株中β-葡萄糖苷酶的分泌表达。     

β-葡萄糖苷酶Bgl747的定向筛选、重组表达与酶学性质

【背景】β-葡萄糖苷酶(β-Glucosidase,EC3.2.1.21)是3种纤维素酶中的重要成分之一。目前工业用纤维素酶大都来源于木霉等真菌,较少来源于细菌,而且在应用中还存在反应条件(温度、pH等)适用范围窄、酶活力较低、获取成本偏高等问题,这大大限制了β-葡萄糖苷酶的应用。从秸秆还田土壤细菌中筛选β-葡萄糖苷酶有极大地可能性筛选出酶学性质较好的酶,从而解决现存的工业问题。【目的】从土壤中筛选β-葡萄糖苷酶,通过基因重组、表达优化和蛋白纯化获得一株新型β-葡萄糖苷酶,探究其酶学性质,为其在工业上的应用奠定基础。【方法】利用功能筛选法从土壤中筛选出β-葡萄糖苷酶,全长为747 bp,命名为Bgl747,构建重组表达质粒pET-28a-Bgl747,以Escherichia coli BL21(DE3)为宿主菌株,经IPTG诱导实现可溶性表达并优化表达条件,通过His标签蛋白纯化试剂盒纯化获得纯化酶,探究其酶学性质。【结果】β-葡萄糖苷酶Bgl747属于BglB超家族,分子量为27.23 kD,最适反应温度为45°C,最适p H 4.0;最佳诱导条件:当OD600为1.0,加入终浓度为0.6 mmol/L的IPTG,于37°C、220 r/min诱导10 h后β-葡萄糖苷酶Bgl747蛋白获得最高表达量1.82 mg/m L;底物为对硝基苯-β-D-半乳糖苷(p-Nitrophenyl-β-D-Galactopyranoside,p NPG)时的比酶活225.07 U/mg,米氏常数Km值和最大反应速率Vmax分别为0.268mmol/L、547.23μmol/(L·min);1mmol/LK+、1 mmol/L和10 mmol/L Fe2+、30%甲醇、30%乙醇、1 mmol/L和10 mmol/L盐酸胍对酶活都有促进作用,30%TritonX-100及10 mmol/L SDS抑制其酶活效果较为明显;该酶受到产物葡萄糖的反馈抑制,葡萄糖浓度越高,抑制效果越明显,但当葡萄糖浓度为1 mol/L时,酶活仍保持50%以上。【结论】Bgl747反应温度范围较广且稳定,酶学性质优异,为其在纤维素降解等工业应用奠定基础。     

枯草芽胞杆菌基因组删减对异源酶表达影响的研究进展

枯草芽胞杆菌作为一种遗传背景清晰、基因编辑成熟的革兰氏阳性菌,是多种重要工业酶的生产宿主。随着转录组、蛋白质组、代谢组等多组学测序和分析技术的发展,通过合理设计简化枯草芽胞杆菌基因组,减少细胞内冗余的调控和代谢网络,使得细胞更精简且便于控制,展现出了枯草芽胞杆菌作为异源酶表达宿主细胞的应用潜力。本文简要综述了枯草芽胞杆菌基因组删减的研究进展,归纳了必需基因的确定方法,重点介绍了枯草芽胞杆菌通过删减基因组提升异源酶表达的研究进展及删减策略,充分展示了枯草芽胞杆菌基因组删减在构建异源酶表达底盘细胞中的重要作用。     

乳酸菌食品级表达载体的研究与应用

乳酸菌是能够发酵糖类产生大量有机酸的革兰氏阳性菌的通称,在发酵食品中有着悠久的应用历史。乳酸菌通常被认为是安全菌株,这些微生物的基因工程操作在食品、医学等方面具有广阔的应用前景。表达载体是基因工程中常用的工具之一,大多数乳酸菌的表达载体通常以抗生素抗性基因作为选择标记,然而抗性基因具有潜在的转移性,因此需要开发食品级表达载体。食品级表达载体不含有抗生素的抗性基因,仅包含来自同源宿主或通常被认为是安全生物的DNA。本文介绍了乳酸菌食品级表达载体的构成及其常用宿主,同时对乳酸菌食品级表达载体的应用进行了归纳总结。     

稳定表达禽β防御素6的DF-1细胞系的建立及其抑菌活性

【背景】禽β防御素6是禽体内分泌的一类抗菌肽,在抵抗病原入侵和免疫调节中发挥着重要作用,但其常规表达方式效率较低,难以在产业化生产中加以应用。【目的】建立稳定表达AvBD6的细胞系,并检测其表达产物对耐药大肠杆菌的抗菌活性,为其他防御素表达提供参考。【方法】利用显微镜观察构建真核重组表达载体pLOV-eGFP-AvBD6转染至293T细胞后的转染效率;收集293T细胞上清液并感染DF-1细胞,通过嘌呤霉素加压筛选稳定表达株;利用RT-PCR和Western Blot分别检测目的基因在转录水平和蛋白水平的表达情况;利用扫描电镜观察细胞培养上清液对耐药大肠杆菌的抗菌效果及其对菌体的损伤。【结果】成功构建重组表达载体pLOV-eGFP-AvBD6,筛选出稳定表达AvBD6的DF-1细胞系,而且目的基因在转录水平和蛋白水平均有表达;细胞培养上清显著降低大肠杆菌和副伤寒沙门菌存活率,对金黄色葡萄球菌的抗菌活性较低。【结论】建立了稳定表达AvBD6的DF-1细胞系,其表达产物对耐药大肠杆菌具有良好的抗菌效果,对推动防御素的应用提供技术支持。