YPS1/YPS2失活改进酿酒酵母An-α菌株β-葡萄糖苷酶分泌表达

[背景] 工业酵母菌株的蛋白质表达通常存在表达量低、分泌效率低的问题。[目的] 考察失活Yapsin蛋白酶Yps1p和Yps2p对β-葡萄糖苷酶在酿酒酵母An-α菌株中表达的影响。[方法] 利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术,首先构建得到未折叠蛋白响应（Unfolded Protein Response,UPR）指示菌株An-α（leu2：：UPRE-lacZ）即An-αL,然后分别失活其YPS1和YPS2基因,导入以YEplac195为载体的β-葡萄糖苷酶表达质粒（简称BG）,进行生长和酶活分析评价。[结果] 菌株An-αL的YPS1和YPS2基因失活对其在酵母浸出粉胨葡萄糖（Yeast Extract Peptone Dextrose,YPD）培养基中的生长未造成明显的不利影响;导入质粒BG后将在酵母浸出粉胨纤维二糖（Yeast Extract Peptone Cellobiose,YPC）培养基中生长的最大OD₆₀₀分别提高了21.9%和7.4%;最大总酶活值为0.087 5和0.068 6 U/（mL·OD₆₀₀）,是对照菌株相应值的2.268倍和1.778倍;分泌比例提高了19.4%和22.2%;β-葡萄糖苷酶表达水平与β-半乳糖苷酶酶活水平所代表的UPR信号响应值之间呈现良好的相关性。[结论] YPS1和YPS2基因失活有助于改进酿酒酵母An-α菌株中β-葡萄糖苷酶的分泌表达。     

UPRE-lac Z为报告基因评价酵母UPR响应初步研究 *

目的: 未折叠蛋白质反应UPR是酵母最重要蛋白质质量控制机制之一,研究UPR响应规律有助于优化异源蛋白分泌途径合成和应对酸醇等胁迫因子的细胞自我保护。方法: 选择实验室菌株W303-1A和工业菌株An-a,以UPRE启动子控制下的Lac Z为报告基因,利用CRISPR/Cas9技术构建得到指示菌株W303-1A (leu 2::UPRE-lac Z)和An-a (leu 2::UPRE- lac Z),分别简称WZ和AZ。结果: 生长曲线测定显示WZ和AZ与亲本菌株的生长接近;添加下述试剂孵育4h后测定β-半乳糖苷酶酶活:1μg/ml衣霉素、8%(v/v)乙醇、0.3%(v/v)乙酸、5%(v/v)乙醇+0.1%(v/v)乙酸;菌株AZ的比酶活分别是对照值的8.2、26.4、1.1和7.9倍,而菌株WZ则分别为12.6、2.4、1.0和1.0倍;进一步以YEplac195为载体表达β-葡萄糖苷酶,AZ和WZ转化子在2%纤维二糖中生长24h的β-葡萄糖苷酶酶活值分别为0.35和6.12U/ml,相应的LacZ则分别为对照值的3.1和5.4倍。结论: 两个菌株显示了在抑制物和异源蛋白表达UPR响应和调控能力上的显著差异,为其改造利用提供了方向;研究也为分析抑制物耐受性和异源蛋白表达关键制约因素、优化酵母ER和UPR信号通路的调控奠定了初步方法基础。     

CRISPR-Cas9系统介导的工业酵母营养缺陷型菌株构建

以组氨酸营养缺陷型菌株构建为例,在前期分离、诱变和筛选得到的安琪酵母工业菌株衍生菌株K-a中试用CRISPR-Cas9系统进行基因修饰。针对菌株K-a为单倍体、ura3和对潮霉素B敏感的特点,构建了以URA3为选择标记的Cas9表达载体YCplac33-Cas9、以hph NT1为选择标记的gRNA表达载体pRS42H-gHIS1,使用PCR方法合成donor DNA片段。使用醋酸锂法制备感受态细胞K-a (YCplac33-Cas9)、将pRS42H-gHIS1和donor DNA共转化,涂布(CMG~(-URA)+300μg/ml潮霉素B)平板,经表型筛选和PCR产物测序证明筛选平板生长菌落为目的转化子K-a (his1)的比例为74. 4%,初步建立了适于利用CRISPR/Cas 9系统进行基因修饰的工业菌株宿主平台和相应的简便、快速进行基因修饰的操作技术流程。     

微生物发酵法生产环磷酸腺苷研究进展

环磷酸腺苷(3',5'-cyclic adenosine monophosphate,cAMP)是普遍存在于生物机体内并起着十分重要作用的生理活性物质,称为第二信使。cAMP于1957年被首次发现报道,随后因为它在生命活动中的特殊地位和作用而被大量研究,外源性cAMP早在上世纪70年代就已开发成人类临床药物,在动物生产领域也有极大的潜在应用价值。目前已知临床用cAMP原料药全部由化学法合成。而微生物发酵法生产菌种则以节杆菌、枯草芽孢杆菌和酵母为代表;运用代谢调控机理和技术,用节杆菌发酵生产cAMP的产量据报道已达≥7.23 g/L,用枯草芽孢杆菌也已达到6~7g/L,而酵母作为典型的模式生物,虽然cAMP-PKA信号转导途径基础研究历史悠久,但发酵生产cAMP则近几年才有报道。目前,除了进一步改造菌株、优化发酵技术提高产量和解决分离提纯问题外,充分发挥微生物发酵法的潜力和优势、弥补化学法合成的不足,是赢得其产业化契机的关键。