5个棉蚜组织蛋白酶B基因克隆及在不同寄主专化型中的表达分析

昆虫组织蛋白酶B在昆虫代谢中发挥着重要作用。本研究从棉蚜Aphis gossypii Glover的转录组数据库中挑选Cath B并克隆得到全长cDNA序列,使用qRT-PCR分析这些基因在不同寄主专化型棉蚜不同龄期中的相对表达量。通过分析棉蚜体内5个高表达组织蛋白酶B基因不同发育阶段的表达谱,比较了不同专化型棉蚜在寄主转换之后的表达差异。研究发现,这5个基因在不同龄期不同寄主上均表达。棉花型棉蚜在棉花寄主上不同基因间的表达各不相同。黄瓜型棉蚜在黄瓜Cucumis sativus L.上AgCb-1、AgCb-2、AgCb-3基因均在成蚜时期表达量相对较高,AgCb-4、AgCb-5基因表达量则与之相反。分别将棉花型棉蚜和黄瓜型棉蚜转接到西葫芦Cucurbita pepo L.上后,棉花型棉蚜AgCb-1、AgCb-4基因和黄瓜型棉蚜AgCb-1、AgCb-2、AgCb-3基因均在成蚜不同时期的表达量显著大于转接前。结果表明：AgCb-1、AgCb-2、AgCb-3、AgCb-4、AgCb-5基因表达量伴随着棉蚜的生长发育以及寄主的转换,表现出不同的差异。说明组织蛋白酶在棉蚜对寄主植物的适应性过程中可能发挥作用。     

棉蚜溶菌酶基因AgLYS的克隆与表达分析

【目的】克隆棉蚜Aphis gossypii Glover溶菌酶基因并进行原核表达,分析其在不同日龄和不同寄主植物上棉蚜体内的表达特征,为进一步研究溶菌酶的功能及其与棉蚜共生菌间的关系奠定基础。【方法】以无翅棉蚜成虫总RNA为模板,采用RT-PCR与RACE方法获得棉蚜溶菌酶基因的cDNA全长序列;将信号肽序列剪切后的棉蚜溶菌酶基因片段连接到原核表达载体pET-30a,并转化到大肠杆菌Eschericha coli中进行诱导表达;采用定量PCR方法测定该基因在不同日龄(1-19日龄)以及西葫芦、黄瓜和豇豆等不同寄主植物上棉蚜体内的相对表达量。【结果】克隆获得棉蚜溶菌酶基因,命名为AgLYS(Gen Bank登录号:KY575341),cDNA全长为680 bp,开放阅读框为516bp,编码172个氨基酸残基。AgLYS的N-末端含有长度为36个氨基酸残基的信号肽序列。系统发育分析表明,棉蚜溶菌酶属于i型溶菌酶,并且与豌豆蚜Acyrthosiphon pisum i型溶菌酶基因的氨基酸序列一致性达90%。AgLYS可在大肠杆菌中诱导表达,表达蛋白分子量为20 k D左右。AgLYS在1-19日龄的棉蚜体内均有表达,但在1-9日龄棉蚜体内表达量较低,11日龄后的棉蚜体内表达量极显著升高(P0.01)。同时,在西葫芦上饲养的棉蚜体内AgLYS的表达量极显著高于在黄瓜和豇豆上饲养的棉蚜体内的表达量(P0.01)。【结论】从棉蚜中克隆获得了i型溶菌酶基因AgLYS,并在大肠杆菌中诱导表达。棉蚜AgLYS基因的表达量受蚜虫日龄及所取食寄主种类的影响,推测棉蚜i型溶菌酶AgLYS可能与棉蚜体内共生菌种群密度的调控相关。     

棉蚜唾液蛋白C002基因克隆及在棉蚜不同寄主专化型中的表达分析

C002是蚜虫取食过程中的一种十分重要的水溶性唾液蛋白。本研究从棉蚜的转录组数据中,克隆得到棉蚜C002基因的c DNA序列(Gen Bank登录号:AHX71991.1)。C002基因的开放阅读框全长为641 bp,编码213个氨基酸,推测其蛋白质的分子质量为24.1 k Da,等电点为9.06,具有由24个氨基酸组成的信号肽。运用荧光定量PCR技术,分析棉花型棉蚜和黄瓜型棉蚜的时间表达谱,结果表明,C002基因在两种寄主专化型棉蚜生长发育的早期阶段表达量均较高。将棉花型棉蚜和黄瓜型棉蚜分别转接到西葫芦后,C002基因的表达量在转接前后无显著变化,说明C002基因在棉蚜适应寄主过程中并没有起到关键性作用。     

苹果黄蚜细胞色素P450基因AcCYP6CY14的表达及其在抵抗吡虫啉中的作用

【目的】研究苹果黄蚜Aphis citricola细胞色素P450基因AcCYP6CY14的表达及其在抵抗吡虫啉中的作用。【方法】搜索苹果黄蚜转录组数据库,获得细胞色素P450基因AcCYP6CY14的cDNA部分序列,采用RT-PCR技术克隆目的基因cDNA序列全长。利用实时定量PCR(Real-time quantitative PCR,RT-qPCR)技术测定目的基因在苹果黄蚜不同发育阶段的表达水平。采用浸虫法,用浓度为LC30的吡虫啉对苹果黄蚜3龄若蚜进行诱导,RT-qPCR检测吡虫啉诱导不同时间后P450基因的表达情况。利用RNA干扰(RNAi)技术沉默苹果黄蚜3龄若蚜的P450基因,并研究该基因沉默后,苹果黄蚜对吡虫啉的敏感性。【结果】获得苹果黄蚜细胞色素P450基因的cDNA全长序列,为1 542 bp,编码513个氨基酸,命名为AcCYP6CY14(GenBank登录号:MH717248)。研究发现该基因在苹果黄蚜各个发育阶段均有表达,在3龄若蚜中表达量最高。经吡虫啉诱导12 h后,该基因的相对表达量显著高于对照。dsRNA饲喂结果显示,苹果黄蚜取食ds AcCYP6CY14 24 h后,将其转接到新鲜的苹果嫩稍上,24、48、72 h后,该基因的表达量显著下调。沉默该P450基因后,苹果黄蚜对吡虫啉的敏感性极显著升高(P0.01),死亡率提高了65.2%。【结论】克隆得到了苹果黄蚜P450基因AcCYP6CY14的cDNA全长序列,该基因在苹果黄蚜整个生育期均有表达,且在3龄若蚜中表达量最高,推测该基因可能参与了苹果黄蚜对吡虫啉的解毒代谢。     

南亚实蝇鞣化激素基因的克隆与表达分析

【目的】克隆南亚实蝇Zeugodacus tau鞣化激素基因,分析其分子特征及时空表达模式,为探索其生理功能奠定基础。【方法】利用同源克隆和RACE技术从南亚实蝇刚羽化成虫中克隆鞣化激素基因bursicon-α和bursicon-β的全长cDNA序列,并用邻接法(neighbor-joining method)与其他昆虫同源序列构建系统发育进化树。利用荧光定量PCR技术检测这两个基因在南亚实蝇不同发育阶段(卵、1-3龄幼虫、预蛹、蛹和刚羽化成虫)的表达特性。【结果】克隆获得南亚实蝇鞣化激素基因bursicon-α(GenBank登录号:MH421861)和bursicon-β(GenBank登录号:MH421862)。bursicon-α基因开放阅读框为551 bp,编码183个氨基酸;bursicon-β基因开放阅读框为467 bp,编码156个氨基酸。基于两个鞣化激素基因的氨基酸序列的系统发育树分析显示,南亚实蝇Bursicon-α与Bursicon-β均与瓜实蝇Zeugodacus cucurbitae的同源蛋白亲缘关系最近,且与其他双翅目昆虫的同源蛋白聚为一类,形成独立的分支。荧光定量PCR结果表明,两个基因在南亚实蝇各龄期均有表达,均在第5天蛹和刚羽化成虫翅伸展时期表达量最高。【结论】bursicon-α和bursicon-β基因在南亚实蝇不同发育阶段表达量不同,推测其在南亚实蝇成虫表皮鞣化和翅的形成中发挥着重要作用。本研究为进一步探索鞣化激素在南亚实蝇生长过程中表皮的骨化、翅的重建等方面的功能机制奠定了基础。     

星豹蛛两个GST基因克隆、鉴定及其对溴氰菊酯胁迫的响应表达

【目的】为明确星豹蛛Pardosa astrigera体内2个谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferases, GSTs)基因的时空表达模式，并探究其是否能对溴氰菊酯的胁迫做出响应。【方法】基于星豹蛛转录组数据库，PCR克隆星豹蛛GST基因PaGSTd1和PaGSTd2全长cDNA序列并进行生物信息学分析；利用RT-qPCR检测PaGSTd1和PaGSTd2在星豹蛛不同发育阶段(2-6龄若蛛和成蛛)、雌雄成蛛不同组织(头胸部、腹和足)以及通过药膜法利用不同浓度[LC₁₀(5.151 mg/L), LC₃₀(8.619 mg/L)和LC₅₀(12.311 mg/L)]溴氰菊酯胁迫不同时间(6, 12, 18, 24和48 h)雄成蛛中的表达量。【结果】星豹蛛PaGSTd1(GenBank登录号：OR096398)全长cDNA序列长708 bp,开放阅读框长645 bp,编码214个氨基酸；星豹蛛PaGSTd2(GenBank登录号：OR096399)全长cDNA序列长793 bp,开放阅读框长64...     

棉蚜寄主专化型及其形成的行为机理

通过生活在甜瓜和棉花上的棉蚜Aphisgossypii Glover的行为,研究棉蚜的寄主专化型及其形成的行为机理。生物学观察显示： 两类棉蚜在寄主植物相互交换以后,定居数显著减少,棉花蚜型棉蚜的繁殖系数及若虫存活率显著下降,说明棉蚜存在甜瓜蚜型和棉花蚜型两种寄主专化型。通过刺探电位技术研究棉蚜的取食行为,以探索其寄主专化型形成的行为机理。结果表明： 甜瓜蚜型棉蚜在棉花上的取食行为容易被中断,但其口针定位韧皮部的能力并没有显著削弱;而棉花蚜型棉蚜在甜瓜上的取食行为受到更大的影响,口针无法顺利定位至韧皮部,并在2 h内根本无法在筛管内取食。生物学观察和EPG取食行为分析都显示： 与甜瓜蚜型棉蚜相比,棉花蚜型棉蚜对寄主的要求更严格-寄主专化程度更高,对寄主的利用率更高。     

绿豆象气味受体基因的克隆和时空表达谱

【目的】本研究旨在克隆绿豆象Callosobruchus chinensis触角4个普通气味受体(odorant receptor, OR)基因,明确这些OR基因在绿豆象不同日龄雌雄成虫组织中的表达谱,为进一步研究基因功能奠定基础。【方法】基于绿豆象成虫触角转录组数据,预测绿豆象OR候选基因;利用RT-PCR克隆绿豆象4个OR基因的全长cDNA序列,并对其进行生物信息学分析;利用qPCR检测这4个OR基因在绿豆象雌雄成虫不同组织(触角、不含触角的头、腹、足和翅)中以及1, 3和5日龄雌雄成虫触角中的表达量。【结果】根据预测的基因序列,克隆得到4个绿豆象气味受体基因的cDNA全长序列,分别命名为CchiOR8,CchiOR10,CchiOR16和CchiOR39,GenBank登录号分别为MW732665, MN832705, MW732664和MN832706;编码的氨基酸数目分别为369, 352, 400和367。系统发育树分析表明,CchiOR8, CchiOR10和CchiOR16均与大猿叶甲Colaphellus bowringi的同源蛋白亲缘关系较近,而CchiOR39与果...     

褐飞虱丝氨酸蛋白酶抑制剂基因Nlserpin4的克隆及表达模式分析

摘要: 【目的】克隆和分析褐飞虱Nilaparvata lugens丝氨酸蛋白酶抑制剂基因Nlserpin4,并探明其时空表达谱和病原真菌诱导表达模式。【方法】基于褐飞虱转录组和全基因组序列数据,利用PCR技术克隆得到褐飞虱Nlserpin4基因的全长cDNA序列;利用生物信息学手段分析其核苷酸和蛋白质序列特征;通过qRT-PCR技术检测其在褐飞虱不同发育时期(卵、1-5龄若虫和初羽化雌雄成虫)和5龄若虫不同组织(脂肪体、肠道、血淋巴和剩余虫体)中的时空表达谱,以及金龟子绿僵菌Metarhizium anisopliae注射感染褐飞虱5龄若虫不同时间后的诱导表达模式。【结果】克隆获得褐飞虱Nlserpin4基因全长cDNA序列(GenBank登录号: MN822802),其开放阅读框长1 227 bp,编码408个氨基酸,蛋白的相对分子质量和等电点分别为45.91 kD和6.23。氨基酸序列分析表明,Nlserpin4蛋白无糖基化位点,N端包含一段由23个氨基酸残基组成的信号肽,C端具有serpin蛋白家族典型的RCL区,且含有能被靶标蛋白酶识别的活性裂解位点。系统发育分析表明,Nlserpin4与半翅目其他昆虫的serpin亲缘关系较近,其中与蔗黄伪毛蚜Sipha flava serpin4的亲缘关系最近。qRT-PCR分析表明,Nlserpin4基因表达具有明显的时空特异性,其在成虫中的表达量显著高于在其他龄期的,且在雄成虫中表达量最高;Nlserpin4基因在褐飞虱5龄若虫脂肪体、肠道、血淋巴和剩余虫体中均有表达,且在剩余虫体组织中表达量最高;病原真菌金龟子绿僵菌诱导48 h内Nlserpin4表达量均显著下调,但随着诱导时间的增加,Nlserpin4表达量呈回升趋势。【结论】褐飞虱Nlserpin4基因在褐飞虱不同发育阶段、不同组织以及病原真菌金龟子绿僵菌诱导不同时间下差异表达。研究结果为深入研究Nlserpin4在褐飞虱生长发育和免疫调节中的功能奠定了基础。     

烟粉虱MEAM1隐种磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶基因克隆与表达分析

【目的】本研究旨在从烟粉虱Bemisia tabaci中东-小亚细亚1隐种(Middle East-Asia Minor 1, MEAM1)中克隆磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶(phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase, PHGPX)基因,鉴定其在烟粉虱不同发育阶段及吡虫啉处理不同时间后雌成虫体内的表达情况,明确其在烟粉虱应对外界环境压力中的功能。【方法】利用3′RACE克隆和测定烟粉虱MEAM1隐种内PHGPX基因的cDNA全长序列,并对其编码的氨基酸序列进行生物信息学分析;利用定量RT-PCR技术对该基因在烟粉虱MEAM1隐种不同发育阶段及吡虫啉处理不同时间后雌成虫体内的表达量进行分析。【结果】获得了烟粉虱MEAM1隐种两个磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶基因的全长cDNA序列,分别命名为BtB-PHGPX1(GenBank登录号:KY312116)和BtB-PHGPX2(GenBank登录号:KY312117)。序列分析表明,BtB-PHGPX1基因开放阅读框全长732 bp,编码243个氨基酸;BtB-PHGPX2基因开放阅读框全长567 bp,编码188个氨基酸。序列比对结果表明两基因的编码蛋白内均具有谷胱甘肽过氧化物酶保守的半胱氨酸、谷氨酰胺和色氨酸残基位点。BtB-PHGPX1在烟粉虱MEAM1隐种卵内表达量显著高于其在若虫、伪蛹、雌成虫和雄成虫内的表达量,BtB-PHGPX2在烟粉虱MEAM1隐种卵内的表达量显著低于其在若虫、伪蛹和雌成虫内的表达量(P<0.05)。BtB-PHGPX1和BtB-PHGPX2在雌成虫内的表达量均显著高于雄成虫内。吡虫啉处理雌成虫2 h时两基因的表达量均较对照显著提高(P<0.05),处理后5, 10和24 h时其表达量均较对照显著下降(P<0.01)。【结论】本研究克隆了烟粉虱MEAM1隐种两个PHGPX基因的序列全长,明确了其在不同发育阶段及吡虫啉处理不同时间后雌成虫体内的差异表达,推测PHGPX在烟粉虱抵御环境压力及杀虫剂胁迫时可能发挥着重要的防御作用。     

桃蛀螟成虫Orco嗅觉受体基因的克隆及组织表达谱分析

【目的】克隆桃蛀螟Conogethes punctiferalis (Guenée)的Orco嗅觉受体基因, 并研究其在不同组织的表达谱。【方法】利用PCR技术克隆桃蛀螟触角Orco基因, 对该基因编码的氨基酸序列进行生物信息学分析, 并利用荧光定量PCR技术分析该基因在的表达量。【结果】获得桃蛀螟成虫Orco的cDNA全长序列, 并命名为CpunOrco（GenBank登录号： JX101681）。该基因的开放阅读框全长1 425 bp, 编码475个氨基酸, 序列中有7个跨膜区。对桃蛀螟成虫不同组织中CpunOrco的荧光定量PCR结果表明, CpunOrco主要在触角和下颚须中表达, 雄虫触角中的表达量高于雌虫, 并且该基因在其他组织中也有一定的表达。【结论】本研究明确了该嗅觉受体基因在桃蛀螟成虫不同组织内的表达水平, 为进一步研究其功能提供了理论依据。     

亚洲玉米螟卵黄原蛋白受体基因的克隆及在UV-A胁迫下的表达分析

【目的】本文旨在克隆亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis卵黄原蛋白受体(VgR)基因,分析其表达模式,探索UV-A胁迫对亚洲玉米螟VgR基因表达的影响。【方法】利用RT-PCR与RACE技术克隆亚洲玉米螟VgR基因的全长序列;运用生物信息学方法分析该基因特征;采用RT-qPCR技术检测不同发育阶段(卵、1-5龄幼虫、蛹、成虫)、雌成虫不同组织(头、足、表皮、卵巢、中肠、脂肪体)、雌成虫不同时长(0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4和4.5 h)UV-A胁迫下该基因的相对表达量。【结果】克隆获得了亚洲玉米螟VgR基因,命名为OfVgR(GenBank登录号:MN058042),其全长6 289 bp,开放阅读框(ORF)5 490 bp,编码1 829个氨基酸,预测蛋白分子量为205.27 ku,N端前31个氨基酸为信号肽。序列分析显示,OfVgR具有2个配体结合域(LBD)、2个表皮生长因子前体同源域(EGFP)、跨膜域(TMD)和胞质尾域。系统发育树分析表明,OfVgR与鳞翅目昆虫VgR聚为一支,亲缘关系较近。RT-qPCR检测结果表明,OfVgR在亚洲玉米螟各发育阶段均有表达,其中在卵和雌成虫中高表达,并在雌成虫羽化24 h时表达量达到最高;雌成虫不同组织中,OfVgR在卵巢中表达量最高;OfVgR表达量随着UV-A照射时间的延长呈先下降后上升再下降的趋势,在3.0 h达到最高值。【结论】亚洲玉米螟OfVgR在不同发育阶段,雌成虫不同组织和UV-A胁迫不同时间的雌成虫中差异表达,对探索UV-A胁迫对亚洲玉米螟生殖的分子机制影响奠定基础。     

褐飞虱丝氨酸蛋白酶抑制剂基因Nlserpin4的克隆及表达模式分析

【目的】克隆和分析褐飞虱Nilaparvata lugens丝氨酸蛋白酶抑制剂基因Nlserpin4,并探明其时空表达谱和病原真菌诱导表达模式。【方法】基于褐飞虱转录组和全基因组序列数据,利用PCR技术克隆得到褐飞虱Nlserpin4基因的全长cDNA序列;利用生物信息学手段分析其核苷酸和蛋白质序列特征;通过qRT-PCR技术检测其在褐飞虱不同发育时期(卵、1-5龄若虫和初羽化雌雄成虫)和5龄若虫不同组织(脂肪体、肠道、血淋巴和剩余虫体)中的时空表达谱,以及金龟子绿僵菌Metarhizium anisopliae注射感染褐飞虱5龄若虫不同时间后的诱导表达模式。【结果】克隆获得褐飞虱Nlserpin4基因全长cDNA序列(GenBank登录号:MN822802),其开放阅读框长1 227 bp,编码408个氨基酸,蛋白的相对分子质量和等电点分别为45.91 kD和6.23。氨基酸序列分析表明,Nlserpin4蛋白无糖基化位点,N端包含一段由23个氨基酸残基组成的信号肽,C端具有serpin蛋白家族典型的RCL区,且含有能被靶标蛋白酶识别的活性裂解位点。系统发育分析表明,Nlserpin4与半翅目其他昆虫的serpin亲缘关系较近,其中与蔗黄伪毛蚜Sipha flava serpin4的亲缘关系最近。qRT-PCR分析表明,Nlserpin4基因表达具有明显的时空特异性,其在成虫中的表达量显著高于在其他龄期的,且在雄成虫中表达量最高;Nlserpin4基因在褐飞虱5龄若虫脂肪体、肠道、血淋巴和剩余虫体中均有表达,且在剩余虫体组织中表达量最高;病原真菌金龟子绿僵菌诱导48 h内Nlserpin4表达量均显著下调,但随着诱导时间的增加,Nlserpin4表达量呈回升趋势。【结论】褐飞虱Nlserpin4基因在褐飞虱不同发育阶段、不同组织以及病原真菌金龟子绿僵菌诱导不同时间下差异表达。研究结果为深入研究Nlserpin4在褐飞虱生长发育和免疫调节中的功能奠定了基础。     

萝卜蚜反-β-法尼烯结合蛋白基因的时空表达模式分析（英文）

【目的】气味结合蛋白(odorant binding proteins,OBPs)有助于提高昆虫嗅觉系统的敏感性,并且在蚜虫报警信息素反-β-法尼烯[(E)-β-farnesene EBF]的通信过程中起重要作用。萝卜蚜Lipaphis erysimi是十字花科作物的主要害虫,为了减少蔬菜田间的农药使用,EBF对蚜虫防治具有很大的潜力。然而,目前萝卜蚜对EBF反应的研究甚少。【方法】本研究利用PCR和RACE技术克隆并鉴定了2种公认的在萝卜蚜中对EBF具有高度亲和力的气味结合蛋白的基因LeryOBP3和LeryOBP7;利用RT-qPCR检测了它们在萝卜蚜不同发育阶段和无翅成蚜不同组织中的表达谱。【结果】克隆获得的萝卜蚜2个基因序列LeryOBP3(Gen Bank登录号:KJ703012)和LeryOBP7(Gen Bank登录号:KJ703013)分别与豌豆蚜Acyrthosiphum pisum ApisO BP3和ApisO BP7序列对比有较高的氨基酸序列一致性(分别为94%和88%),基因序列符合气味结合蛋白基因的典型特征。LeryOBP3和LeryOBP7开放阅读框全长分别为357和468 bp,分别编码118和155个氨基酸。发育表达谱表明,LeryOBP3和LeryOBP7的表达量高峰出现于成虫期;组织表达谱表明,LeryOBP3在成蚜足中表达量较高,而LeryOBP7主要表达于成蚜触角组织中。【结论】在萝卜蚜成虫触角中的LeryOBP7结合蛋白可能与其对EBF的响应有关。     

硫激肽及其受体调控褐飞虱取食行为

【目的】明确硫激肽(sulfakinin, SK)及硫激肽受体(sulfakinin receptor, SKR)在褐飞虱Nilaparvata lugens取食行为中的作用。【方法】PCR克隆褐飞虱硫激肽基因Nlsk及其受体基因Nlskr cDNA全长序列并进行生物信息学分析；利用qRT-PCR检测Nlsk及Nlskr在褐飞虱不同发育阶段(卵、1-5龄若虫、雄成虫和雌成虫)和雌成虫不同组织(头、触角、翅、口针、足、肠道和马氏管)中的表达量；褐飞虱3龄若虫注射dsNlskr进行基因沉默，qRT-PCR检测4龄若虫中Nlskr的表达量，测定4龄若虫的取食量；基于已构建的Nlskr RNAi后的4龄若虫转录组数据库进行差异表达基因(differentially expressed genes, DEGs)的GO和KEGG分析以及取食相关基因的qRT-PCR验证。【结果】PCR克隆得到了褐飞虱Nlsk(GenBank登录号：AB817281)及Nlskr(GenBank登录号：BAO01059.1)的cDNA全长序列。序列比对结果显示，褐飞虱NlSK成熟肽具有与其他物种保守的C端FMRFam...     

梨小食心虫生物钟基因Gmper和Gmtim的鉴定及其对羽化节律的影响

【目的】本研究旨在探究梨小食心虫Grapholita molesta生物钟基因Gmper和Gmtim的分子特性与表达模式,分析其对羽化节律的调控作用,为梨小食心虫的防控提供潜在新靶标。【方法】根据梨小食心虫转录组数据,采用PCR技术克隆生物钟基因Gmper和Gmtim的cDNA全长;利用RT-qPCR测定这两个基因在梨小食心虫成虫头、胸、腹和足中的表达量,及其在蛹头部中的日表达模式;应用siRNA进行RNAi技术分析Gmper和Gmtim在梨小食心虫羽化节律中的作用。【结果】克隆获得梨小食心虫Gmper基因(GenBank登录号:MN862636)和Gmtim基因(GenBank登录号:MN862637)全长cDNA。Gmper基因开放阅读框长2 862 bp,编码953个氨基酸,序列中含2个PAS结构域和1个PAC结构域;Gmtim开放阅读框长3 048 bp,编码1 015个氨基酸。Gmper和Gmtim在雌雄成虫头部中的表达水平均高于其他组织中的;蛹期头部两基因在暗期的表达水平显著高于光期的。RNAi下调这两个基因的表达均导致梨小食心虫羽化时间更加分散以及羽化高峰期的羽化成虫数量显著降低。【结论】梨小食心虫生物钟基因Gmper和Gmtim具有组织和昼夜表达差异性,两基因对梨小食心虫羽化节律的调控有重要作用。研究结果为开发基于发育行为节律调控的梨小食心虫监测和防控方法提供了新线索。     

荻草谷网蚜唾液蛋白SmHMp1的基因克隆及基于HIGS技术的功能分析

【目的】荻草谷网蚜Sitobion miscanthi是我国农业生产中的重大害虫之一，其唾液中存在许多功能各异的效应蛋白，在取食过程中参与蚜虫-植物互作。本研究旨在探索荻草谷网蚜唾液蛋白SmHMp1在该蚜虫取食和繁殖过程中的功能，探索其作为沉默靶标用于防治荻草谷网蚜的可行性。【方法】基于荻草谷网蚜唾液腺转录组数据，克隆荻草谷网蚜SmHMp1的cDNA全长序列，并进行生物信息学分析；以RT-qPCR技术测定荻草谷网蚜不同发育阶段(1-4龄若虫以及无翅成蚜)、无翅成蚜不同组织(唾液腺、头、胸、腹、胚胎以及整虫)、不同翅型成蚜(有翅成蚜和无翅成蚜)以及取食不同饲料(人工饲料和小麦苗)的无翅成蚜中SmHMp1基因表达量；以农杆菌Agrobacterium tumefaciens介导的烟草瞬时表达确定SmHMp1蛋白的亚细胞定位；构建大麦条纹花叶病毒(barley stripe mosaic virus, BSMV)重组病毒载体，利用寄主诱导的基因沉默技术(host-induced gene silencing, HIGS)沉默荻草谷网蚜SmHMp1基因后，通过解剖、生命表和刺探电位(elect...     

棉花型和瓜型棉蚜产生有性世代能力的分化

为了明确寄主专化性是否会影响棉蚜的繁殖策略或生活史对策,采用低温和短光照组合（18℃,L∶D=8∶16）分别对棉花型和瓜型棉蚜进行有性世代的诱导,比较两寄主专化型棉蚜产生有翅蚜、雄性母、雌性母及无翅孤雌蚜的能力。结果表明：两寄主专化型棉蚜在产生有性世代能力上存在显著差异,表现为棉花型棉蚜在诱导后代中产生有翅蚜、雄性母和雌性母的比率显著高于瓜型棉蚜,并且雌、雄性母产生的时间明显早于瓜型棉蚜。瓜型棉蚜在诱导条件下产生无翅孤雌蚜的比率显著高于棉花型棉蚜,并且发现有不产生有性世代的营专性孤雌生殖个体,而在棉花型棉蚜中没有发现。产生性母蚜的棉花型和瓜型棉蚜均可同时产生孤雌胎生后代。寄主型与诱导时间长短对棉蚜有性世代的产生存在交互作用。采集于田间棉花和黄瓜上的棉蚜,也表现为棉花上的易产生有性世代,在诱导的第2代中产生性母蚜的比率显著高于黄瓜上的棉蚜,并且性母蚜比率在诱导的第2代与第3代间无显著差异; 但黄瓜上的棉蚜性母蚜产生比率第3代显著高于第2代。由此推测,棉蚜寄主专化性的形成与生活史特性的分化有关。     

松墨天牛漆酶基因MaLac1的克隆、原核表达及表达谱分析

【目的】本研究旨在克隆并鉴定松墨天牛Monochamus alternatus内源漆酶基因MaLac1,分析其在松墨天牛不同发育阶段的表达水平,为进一步明确MaLac1功能提供依据。【方法】基于松墨天牛肠道转录组测序数据,通过RACE克隆松墨天牛MaLac1基因的全长cDNA序列,并对其进行生物信息学分析;将该基因与pET-32a载体链接构建表达载体pET-MaLac1,导入大肠杆菌Escherichia coli Rosetta (DE3)使其表达;使用qPCR检测MaLac1基因在松墨天牛不同发育阶段(低龄幼虫、老熟幼虫、蛹、雌成虫和雄成虫)肠道中的表达差异。【结果】克隆获得松墨天牛MaLac1的cDNA全长序列(GenBank登录号:KY073340)。MaLac1开放阅读框全长2 067 bp,编码一个含688个氨基酸的蛋白质,预测分子量为78.34 kD,等电点为5.30。SignalP 4.1 Server预测MaLac1在N端包含一个15个氨基酸的信号肽。序列比对分析表明,MaLac1具有典型的昆虫漆酶基因特征,与赤拟谷盗Tribolium castaneum漆酶基因的氨基酸序列一致性达93%。SDS-PAGE检测发现IPTG诱导表达了一条大约78 kD的特异蛋白条带,与推测大小一致。qPCR结果显示,MaLac1在不同发育阶段的松墨天牛肠道中均有表达,其中,在雌成虫肠道中表达量最高,在雄成虫肠道中的次之,在幼虫肠道中的最低。【结论】MaLac1在松墨天牛成虫中表达量显著高于其在幼虫中的,这一结果可能与幼虫和成虫的取食习性差异相关。MaLac1在松墨天牛体内的功能还有待进一步研究。