DNA顺序的dd×TP链终止法测定

用Messing的M13克隆系统和sanger的ddxTP链终止法,测定了酵母线粒体DNA片段的核苷酸顺序。为了提高在一张x光胶片上的阅读水平,作者对sanger法的某些操作进行了适当修正。通过降低ddxTP／dxTP的用量比率、多次加样以及合理掌握两次加样的间隔时间和电泳结束时间、ss—DNA模板的筛选等措施,在一张17×80cm的x光胶片上的阅读水平达到394bp,从而测出了酵母线粒体DNA细胞色素b基因的一个大片段为709bp。     

生物素标记寡核苷酸探针探测扩增的病理性突变珠蛋白基因

用末端转移酶催化生物素核苷酸底物(Biotin-ll-dUTP)共价连接在合成的寡核苷酸3’羟基末端,从而合成了两种寡核苷酸探针(β~T_(41-42)及β~A_(41-42))。用它们分别与克隆化扩增的正常和突变的β—珠蛋白基因片段杂变。结果表明该探针都具有与~(32)P探针相似的特异性,其杂交的灵敏度为2—3pg(特异序列)。进而将探测HbS基因的正常和异常两种寡核苷酸19聚体(β~A_6和β~S_6)用~(32)P和生物素分别标记;将HbS杂合子病人的白细胞DNA经聚合酶链反应(PCR)法扩增,并以含正常β—珠蛋白基因的DNA片段作对照,与两种探针分别进行斑点杂交。所得结果完全一致;Hbs杂合子DNA对正常和异常探针都显出杂交信号,而正常DNA只与β~A探针显杂交信号。     

人β干挠素基因在SV40晚期启动子控制下在小鼠骨髓瘤细胞中表达

人成纤维细胞干挠素(Hu-IFN-β)基因的HindⅡ片段,插入载体pSV2-dhfr质粒中SV40晚期启动子(Lp)下游PvuⅡ位点处。用此重组质粒与带有黄嘌呤磷酸核糖转移酶(XGPRT)基因的质粒pSV2-gpt共转染次黄嘌吟核糖转移酶(HGPRT)基因缺陷的小鼠骨髓瘤(SP2/0)细胞。在含有霉酚酸和氨基喋呤的选择培基中,筛选出有效地组成性表达的细胞株。在未加氨甲喋呤压力倍增的条件下,Hu-IFN-β抗病毒活性为1275U/10~5细胞,1ml,48小时。     

异源PDGF-A链表达对CHO细胞生长和转化的作用

用DNA磷酸钙盐沉淀方法把含人PDGF(血小板衍生生长因子)A链cDNA的表达质粒pSV_2neo-A转染CHO细胞(中国仓鼠卵巢细胞),然后经G 418(400-800 μg/ml)筛选分离20个转染细胞株。选出其中At_1和Aot7细胞株所进行的实验结果表明,这些细胞的形态和生长行为均发生明显的变化,PDGF-A链mRNA的表达水平比CHO细胞明显增高,胞质有强阳性的PDGF荧光反应,显示有PDGF样蛋白的合成。这些细胞不但生长速率加快,有高密度持续生长的特性,而且能在软琼脂培基上形成大集落和在裸鼠体内接种形成纤维肉瘤,提示外源PDGF-A链基因的表达有使CHO细胞生长失控和发生细胞恶性转化的作用。