重组大肠杆菌表达铜绿假单胞菌溶血性磷脂酶C

[目的]构建产溶血性磷脂酶C (Hemolytic Phospholipase C,PLCH)的重组大肠杆菌(Escherich coli菌株,并初步优化其发酵条件.[方法]首先利用卵黄硼砂平板分离法筛选到一株产磷脂酶C(Phospholipase C,PLC)活性较高的菌株,命名为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)41;进一步以P.aeruginosa 41基因组DNA为模板设计引物,PCR扩增获得溶血性磷脂酶C(PLCH)基因,构建重组大肠杆菌表达质粒并转化大肠杆菌E.coli BL21 (DE3);筛选转化子并检测PLC活性和溶血能力,并初步优化其发酵条件.[结果]成功构建了重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3) /pET28a-plcH;在硼砂卵黄平板上对重组菌进行PLC活性测定,显示重组菌有明显的磷脂酶C活性;在哥伦比亚血琼脂平板上对重组菌进行溶血性试验,表明PLCH具有较强的溶血活性;初步优化摇瓶发酵条件为:5％转接量,37℃、200 r/min下培养4h添加IPTG至终浓度为0.9 mmol/L,转为25℃、150 r/min诱导培养14 h;优化后重组菌的酶活可达到722.89±0.47 U/mL.[结论]本文成功构建了一株产溶血性磷脂酶C活性较高的重组大肠杆菌菌株,并通过优化发酵条件使其酶活达到了722.89±0.47 U/mL,本实验在国内首次实现了铜绿假单胞菌来源的溶血性磷脂酶C基因在大肠杆菌的胞内表达,该研究为研究磷脂酶C产业化奠定了一定的基础.     

磷脂酶A2亚型及其与男性生殖相关性研究

磷脂酶A2(phospholipase A2,PLA2)是参与细胞代谢活动、信号转导等过程的重要酶类之一,广泛分布于哺乳动物机体内。随着对磷脂酶A2研究的深入,目前已有30余种磷脂酶A2亚型被逐一鉴定,磷脂酶A2亚型与男性生殖相关性研究也有了新的发现。该文通过对磷脂酶A2的最新亚型分类及其特征、磷脂酶A2在男性生殖系统中的分布、磷脂酶A2参与精子顶体反应及其信号转导通路以及与男性生殖相关的磷脂酶A2亚型等内容进行分析,研究磷脂酶A2在男性生殖系统中发挥的作用及其机制,为男性不育的诊断和治疗提供理论依据和思路策略。     

乌司他丁对慢性阻塞性肺疾病患者血清COX-2, PLA-2 及肺功能的影响

目的:探讨乌司他丁对慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者血清环氧合酶-2(COX-2)、磷脂酶A2(PLA-2)及肺功能的影响。方法:选取2015年1月至2016年1月我院收治的82例COPD患者,随机分为观察组和对照组。对照组患者采取COPD常规处理,观察组在对照组的基础上给予乌司他丁,检测两组患者治疗前后的COX-2、PLA-2以及肺功能指标FEV1、FVC及FEV1/FVC。结果:治疗前,观察组和对照组的COX-2、PLA-2水平均无统计学差异(P0.05);治疗后,观察组和对照组的COX-2、PLA-2均比治疗前显著降低,且观察组低于同期对照组,差异均有统计学意义(P0.05)。治疗前,两组患者各项肺功能指标均无统计学差异(P0.05);治疗后,观察组的FEV1、FVC及FEV1/FVC均优于对照组(P0.05)。结论:乌司他丁能够有效降低COPD患者血清COX-2、PLA-2浓度,改善肺功能。     

大孔树脂固定化磷脂酶D

磷脂酶D(PhospholipaseD,EC3.1.4.4,PLD)是催化磷酸酯键水解和碱基交换反应的一类酶的总称.利用PLD的转碱基作用是目前催化合成磷脂酰丝氨酸(PS)的最佳途径.本实验以5种大孔树脂为载体固定化磷脂酶D(PLD)进行了研究.以酶回收率为主要指标,选择了最佳载体和优化了固定化条件.结果表明:非极性阳离子交换树脂H103是最佳固定化载体;其最优固定化条件:加酶液量1.2 mL,固定时间80 min,pH 6.0柠檬酸-柠檬酸钠的缓冲液浓度为10 mmol/L.最佳固定化条件下,固定化之后的PLD比游离PLD酶活提高了三倍.     

老年冠心病患者血清Lp-PLA2、hs-CRP、IL-27及MMP-9水平与Gensini积分的相关性研究*

目的:探讨老年冠心病患者血清脂蛋白相关磷脂酶A2(Lp-PLA2)、高敏C反应蛋白(hs-CRP)、白细胞介素-27(IL-27)及基质金属蛋白酶-9(MMP-9)水平与Gensini积分的相关性。方法:选取2015年10月至2018年2月我院收治的冠心病患者142例为研究对象,将所有患者按照不同的冠心病类型分为不稳定型心绞痛(UAP)组54例、稳定型心绞痛(SAP)组40例和急性心肌梗死(AMI)组48例。同时根据患者Gensini积分将其分为轻度47例、中度51例和重度44例。比较不同冠心病类型、不同严重程度的Lp-PLA2、hs-CRP、IL-27、MMP-9水平及Gensini积分,并分析冠心病患者上述指标水平与Gensini积分的相关性。结果:AMI组患者Lp-PLA2、hs-CRP、IL-27、MMP-9水平及Gensini积分均高于UAP组和SAP组,且UAP组高于SAP组(P0.05)。重度患者Lp-PLA2、hs-CRP、IL-27、MMP-9水平及Gensini积分均高于中度和轻度患者,且中度患者高于轻度患者(P0.05)。经Spearman相关性分析结果显示,冠心病患者Lp-PLA2、hs-CRP、IL-27、MMP-9水平与Gensini积分均呈正相关(P0.05)。结论:老年冠心病患者Lp-PLA2、hs-CRP、IL-27及MMP-9水平与患者冠状动脉病变Gensini积分均呈正相关。临床根据Lp-PLA2、hs-CRP、IL-27及MMP-9水平的变化,有助于评估老年冠心病患者的病情严重程度。     

PLA2R-IgG间接荧光定量免疫层析分析的构建与应用

目的 血清抗磷脂酶A2受体抗体IgG（PLA2R-IgG）水平是诊断和治疗特发性膜性肾病（IMN）的重要依据,而目前国内外常规检测手段主要是酶免法。为提升检测的便捷性,同时满足灵敏、宽量程分析需求,本研究构建了一种新的PLA2R-IgG检测技术。方法 采用包裹铕元素的微球示踪,对反应步骤进行选择,对微球制备液的pH、微球-抗体反应比例和反应时间优化,本文基于间接法构建了PLA2R-IgG的荧光定量免疫层析检测方法,并进行了初步临床评价。结果 本方法的灵敏度达0.7 RU/ml,标准曲线方程为y=0.771x-1.437,相关系数0.995,线性测量范围为0.7~1 500 RU/ml,回收率为86.27%~98.98%,平均批内变异系数为8.13%,交叉反应率均小于0.1%,试剂37℃储存10 d稳定。本方法与市售酶免试剂盒相关性为0.953,阴阳性判断一致,对IMN的检出率为76.9%。结论 采用两步法反应的PLA2R-IgG间接荧光定量免疫层析分析,快速、灵敏、准确,具有临床实用性。     

磷脂酶D和炎症的关系

磷脂酶Ｄ（ＰＬＤ）广泛存在于动物组织细胞中,并受各种胞外信号调节。其主要底物为磷脂酰胆碱（ＰＣ）。ＰＬＣ引起的ＰＣ水解是细胞内重要的信号转导途径。越来越多的证据表明ＰＬＤ和炎症有密切的关系。本文主要介绍ＰＬＤ在呼吸爆发、脱颗粒及花生四烯酸（ＡＡ）释放等方面的研究进展。     

肠缺血/再灌注损伤后白介素1-β水平与磷脂酶A2激活的关系

为了探讨肠缺血/再灌注损伤后IL-1β基因表达和蛋白含量变化与磷脂酶A2抑制之间的关系,采用大鼠肠缺血/再灌注损伤模型,在对照组,损伤组和磷脂酶A2抑制剂处理组动物中收集血清,肺灌洗液,腹腔灌洗液及全身重要脏器组织样品,采用放射免疫法测定IL-1β含量,并且RT-PCR法测定肺组织中IL-1β和Ⅱ型PLA2基因表达,结果表明,损伤后6h血清中IL-1β含量明显高于对照组;损伤后1和3h,腹腔注保IL-1β也明显高于对照组;损伤后肝组织中IL-1β水平有明显增加,而肺,肾、肠组织中IL-1β没有明显变化。损伤后肺灌洗液中IL-1β也明显高于对照组水平,肺组织中IL-1βmRNA表达增加,而Ⅱ型PLA2mRNA在损伤后表达反而有所下降,采用磷脂酶A2抑制剂氯喹,环氧化物酶抑制剂消炎痛,血小板活化因子受体阻断剂SR27417后,IL-1β蛋白和基因表达有不同的改变,提示肠缺血/再灌注损伤后一定时间内,肝内IL-1βmRNA表达和血中IL-1β水平明显增高,但是否与磷脂酶A2激活或其代谢产物的释放有关尚需进一步证明。