FTA-DNA直接提取法在病原真菌分子鉴定中的应用

目的建立并评价FTA-DNA直接提取法在病原真菌分子鉴定中的应用。方法采用whatman FTA-DNA直接提取法从25个不同种属的45株培养的菌株和6例临床标本中提取病原真菌DNA,用于病原真菌的测序鉴定。配制不同浓度的孢子悬液探索该方法的检测限和安全性。结果 45株菌株扩增后均能得到1条清晰的DNA扩增片段,并成功测序。应用该方法亦成功从腹水、胸水、口腔拭子、宫颈拭子来源的临床标本中直接提取DNA并成功鉴定病原真菌。该DNA提取方法联合降落PCR能检测到1.0×103个cell/mL的孢子悬液,1.0×104个cell/mL及以下浓度的孢子悬液可以被FTA卡完全灭活。结论 FTA-DNA直接提取法可快速有效地从培养的菌株及部分临床标本中提取并保存病原真菌DNA,用于病原真菌的测序鉴定。     

华中五味子ISSR-PCR反应体系优化及引物筛选

系统研究了华中五味子ISSR PCR反应体系中的主要影响因子,确立华中五味子ISSR-PCR最适反应体系,并筛选出12条有效引物。单因子实验结果显示,华中五味子ISSR-PCR反应体系中各主要成分的适宜浓度范围为,Mg²⁺ 1.50~3.50 mmol·L^-1,dNTPs 0.10~0.35 mmol·L^-1,引物0.25~0.60 μmol·L^-1,Taq酶0.50~1.50 U。4因子3水平正交实验确立了最适反应体系,即20 μL体系中包含2.50 mmol·L^-1 Mg²⁺、0.20 mmol·L^-1 dNTPs、0.25 μmol·L^-1引物、1.50 U Taq酶、60 ng DNA模板、2.50 μL 10×PCR Buffer。本研究为华中五味子种质资源的评估及遗传多样性分析奠定基础。     

产紫青霉EL-02的分离鉴定及其絮凝活性

摘要：【目的】分离鉴定有絮凝活性真菌,同时对其絮凝活性进行初步研究。【方法】采用梯度稀释、平板划线、18S rDNA检测等方法分离鉴定絮凝活性菌株。通过高速离心、超声破碎、乙醇沉淀、定性试验等方法确定絮凝活性物质性质。【结果】从渤海湾海岸土壤样品中分离筛选出一株有较高絮凝活性的真菌,经鉴定为产紫青霉（Penicillium purpurogenum）,命名为产紫青霉EL-02（P. purpurogenum EL-02）。超声破碎试验证实其絮凝活性主要存在于发酵上清液。根据絮凝活性曲线,确定4 d为积累絮     

百日咳杆菌粘附素对猪源支气管败血波氏杆菌的保护性抗原的筛选

摘要：【目的】本研究通过百日咳杆菌黏附素(PRN)基因的分段克隆表达及其在BALB/c小鼠的主动和被动免疫保护试验筛选PRN中的保护性抗原肽。【方法和结果】利用大肠杆菌进行PRN的完整蛋白、N端和C端多肽及其RI和RII区域多肽（双拷贝）的表达,命名为GST-PRN、GST-PN、GST-PC、GST-2PRI和GST-2PRII。Western blot检测证实5种表达产物均具有良好的反应原性。在主动免疫保护试验中,5种表达产物均能诱导小鼠产生较高的PRN抗体水平;当使用3 LD50的支气管败血波氏杆菌     

角蛋白酶生产菌株的分离筛选与鉴定

【目的】分离筛选具有高效脱毛能力的野生角蛋白酶生产菌株,开发无硫制革生物脱毛剂。【方法】以贮备原料皮的特定环境中的污水样品为菌株源、在含诱导物脱脂羊毛粉的培养基中的富集、筛选与评估其发酵液脱毛能力的多相筛选方法分离选育高产角蛋白酶野生菌株。通过形态学、生理生化特征,Biolog全自动分析以及16SrDNA基因序列分析等方法多尺度地鉴定目的菌株。【结果】定向筛选得到了一株高活力,无硫脱毛效率高的菌株。鉴定结果表明,该菌株为地衣芽孢杆菌属,故命名为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)X-47。【结论】应用多相定位选育技术筛选出的菌株地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)X-47,产角蛋白酶活力高,脱毛效率高,对胶原作用力弱的特点,具有开发无硫脱毛生物助剂的潜力。     

阿维链霉菌Streptomyces avermitilis碱性脂肪酶LpsA2的表达和酶学性质分析

【目的】本研究将推测的阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)脂肪酶基因lpsA2在大肠杆菌(Escherichia coli)中进行异源表达及系统的酶学性质分析。【方法】提取阿维链霉菌基因组,设计特异性引物,PCR扩增脂肪酶基因lpsA2,使其在大肠杆菌中异源表达,利用6个组氨酸标签纯化脂肪酶LpsA2,并进行酶学性质分析;对LpsA2进行序列比对和进化分析。【结果】氨基酸序列比对显示LpsA2具有脂肪酶典型的由Ser、His和Asp构成的活性部位,即Ser130-Asp221-His25,其中Ser位于保守的五肽结构(Gly128-His129-Ser130-Gln131-Gly132)中;分子系统学分析显示,LpsA2是脂肪酶第一家族亚家族成员(Subfamily I.7);实验测得纯化的重组脂肪酶LpsA2的最适反应pH为8.0,最适反应温度为50℃;最适底物为对硝基苯酚豆蔻酸酯;在10℃-50℃范围内该酶的激活自由能为6.3 kcal/mol;1 mmol/L Co2+、Hg2+、Zn2+可使酶活性提高至250%以上;15%的二甲基甲酰胺和二甲基亚砜使酶活分别提高至110.7%和138%;0.1%和1%的Span-20可使酶活性分别提高至352.7%和189.7%。【结论】本研究对推测的来源于S.avermitilis的脂肪酶基因lpsA2进行了异源表达和酶学功能鉴定,不仅为脂肪酶的研究积累了更多数据,也为具有优良性能的脂肪酶生物工程菌的筛选奠定了基础,更为其在食品加工、药物合成等工业生产中的应用提供了依据。     

高温链霉菌质粒pTSC2的测序分析和滚环复制方式的鉴定

从猪粪堆肥中分离到一株编号为X3-3的可以在50℃高温生长的链霉菌菌株,该菌株含有一个约7kb的环型质粒pTSC2。【目的】克隆、测序和分析pTSC2,以及鉴定质粒的复制方式。【方法】利用分段克隆和引物延伸获得pTSC2的全序列,利用多序列比对寻找复制元件rep、dso和sso,利用中性转移和Southern杂交检测复制中间体。【结果】克隆和测序获得了全长为7516bp的pTSC2序列,预测编码8种蛋白,其中4种蛋白与链霉菌滚环复制的质粒pIJ101中负责复制和接合转移的蛋白非常相似。pTSC2的复制元件rep、dso和sso也与pIJ101的相似。克隆、转化变铅青链霉菌ZX7以及高温链霉菌2C证明了rep和dso为复制所必需元件。Southern杂交检测到pTSC2复制过程中积累了大量的单链DNA。【结论】高温链霉菌质粒pTSC2以滚环方式进行复制。这是首次在高温链霉菌中克隆和测序质粒,以及鉴定其复制方式。     

醉马草内生菌的分离、鉴定及杀虫效果

【目的】探明醉马草内生菌的种类,筛选对农作物虫害有毒杀作用的菌株。【方法】采用研磨法从健康醉马草植物的根、茎、叶和种子中进行菌种分离;通过对其形态、培养特征、生理生化及其他生物学特性的研究;16SrDNA及ITS序列的系统发育学分析进行鉴定;用玻片浸渍法和喷雾法筛选产杀虫活性物质菌株。【结果】获得细菌89株,分别属于枯草芽孢杆菌属(Bacillus)、链霉菌属(Streptomyces)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、叶杆菌属(Phyllobacterium)、鞘脂单胞菌属(Sphingomonnas)、类芽孢杆菌(Paenibacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)和不动杆菌属(Acinetobacter)8个属;真菌2株,分别属于麦角菌属(Claviceps)和毛壳菌属(Chaetomium)。经初筛及复筛,内生菌娄彻氏链霉菌Streptomyces rochei(GA)和黑麦麦角菌Claviceps purpurea(PF-2)发酵液粗提物对棉蚜虫(Aphis gossypii)致死率达85%以上。【结论】醉马草内生菌株PF-2和GA的粗提代谢物对棉蚜虫有明显的毒杀作用,为开发新的生物源农药提供了生物源物质。     

现代生物技术在食品工业中的应用

介绍了以基因工程为核心内容,包括细胞工程、酶工程和发酵工程的现代生物技术在改造食品资源、改进食品加工工艺,改善食品质量及开发新型保健食品等方面的应用状况,并展望了其发展前景。     

长春花吲哚生物碱合成途径的基因工程研究进展

对长春花吲哚生物碱合成途径的基因工程研究进行了综述。研究人员为探索利用长春花大量生产抗肿瘤药物长春碱和长春新碱等,对长春花吲哚生物碱的合成途径展开了深入的研究,克隆和鉴定了多个编码合成途径关键酶的基因,并研究了相关转录因子对该合成途径基因表达的调控作用;另外,一些关键基因和转录因子已被用于长春花吲哚生物碱代谢途径的遗传改造,相关研究显示利用基因工程手段提高长春花药用成分含量的可行性。