我国SEO型汉坦病毒全S基因核苷酸序列测定

为获得SEO型病毒基因组更为详尽的资料，也为局部暴发的原因提供科学的资料，我国采用病毒分离、McAbs分型。RT－PCR扩增及核苷酸序列测定的方法，在国内首次测出我国SEO型病毒较为完整的全S片段，并与76－118、Seoul,SRⅡ株的核苷酸及氨基酸同源性进行比较，分别为：64．2％、91．8％、96．8％及80．5％、95．4％、97．3％。表明病毒基因组间的重排不是造成发病高峰的原因。     

黑线姬鼠种群结构与携带汉坦病毒相关性

汉坦病毒(Hantavirus,HV)是肾综合症出血热(Hemorrhagic fever with renal syndrome,HFRS)的主要病原体之一,HV的主要宿主动物为黑线姬鼠(Apodemus agrarius).针对西安市HFRS的持续高发病率,2010年7月-9月对西安市HFRS 疫区捕获的110只黑线姬鼠(阳性62只)进行年龄、性别鉴定.通过病毒RNA提取分析,发现黑线姬鼠雌雄个体携带病毒无显著差异,但是不同年龄段黑线姬鼠携带汉坦病毒却具有显著差异,年龄结构与病毒携带具有极显著的相关性.     

汉坦病毒沟3株PCR分型

汉坦病毒 (HV)沟 3株在以往报道的免疫学中和效价检测 ,为一株中和抗原广谱的毒株。本研究对这一毒株经过两次挑斑纯化 ,并经PCR方法进行分型检定 ,初步认为沟 3毒株为SEO型HV病毒。     

汉坦病毒感染细胞整合素受体信号转导相关差异表达基因筛选

通过基因芯片技术观察汉坦病毒感染细胞后整合素受体信号转导相关基因的差异表达,以探讨汉坦病毒进入细胞的分子机制.用汉滩病毒76-118株感染原代人胚肺成纤维细胞,同时设立正常对照细胞,于感染后第6h、24h和96h同时抽提感染组与正常对照组细胞总RNA,利用荧光标记dUTP逆转录制备cDNA探针,与人类受体及信号转导类表达谱芯片杂交,并对Cy3、Cy5荧光信号做扫描分析.结果显示有37项基因出现差异表达,其中31项基因在感染后6h出现差异表达,13项下调、18项上调;但在感染后24h和96h分别只有5项和4项基因出现表达差异;而且整合素信号转导通路中的重要基因如一些蛋白激酶相关基因在感染6h表达增强,丝化增强子1在感染6h和96h表达下调,微管相关蛋白1A在感染6h表达上调、感染24h和96h表达下调.这些进一步说明汉坦病毒感染细胞与整合素有关.     

人源抗汉坦病毒核衣壳蛋白T7噬菌体抗体库的构建

构建人源T7噬菌体单链抗体(scFv)库筛选抗汉坦病毒核衣壳蛋白(NP)抗体。从肾综合征出血热恢复期患者外周血淋巴细胞中提取总RNA,反转录合成cDNA第一条链,PCR分别扩增抗体重链可变区基因(VH)和轻链可变区基因(VL),经重叠延伸拼接(SOE)PCR组成scFv基因,并将其与T7噬菌体载体的2个臂相连接。体外包装后,在宿主菌BLT5403中,扩增重组噬菌体抗体库。以基因工程表达NP进行4轮“吸附-洗脱-扩增”的筛选,酶免疫实验检测抗体活性。所建抗体库库容为1.35×107,扩增后初级库滴度为2.12×1010pfu/mL。以NP抗原筛选后抗体出现特异性富集,经酶免疫实验鉴定,得到2株与NP抗原特异结合的噬菌体抗体。结果表明,研究成功构建了人源抗NP蛋白T7噬菌体抗体库。     

双歧杆菌肽聚糖对汉坦病毒NP免疫效果的影响

探讨双歧杆菌肽聚糖作为佐剂对汉坦病毒核蛋白(HTNV-NP)免疫效果的影响。提取并制备双歧杆菌肽聚糖(PG),与HTNV-NP混合,免疫接种BALB/c小鼠,检测抗体水平变化,检测IL-2、IFNγ,淋巴细胞增殖实验检测免疫应答效果。同时观察PG的安全性。注射HTNV-NP组产生平均抗体滴度(GMT值)为74.21±17.38,IL-2和IFNγ的产生水平分别为(9.32±1.21)U/L和(97.78±6.54)U/L,淋巴细胞增殖反应刺激指数(SI)为1.7;注射HTNV-NP PG组GMT值为1276.23±94.67,IL-2和IFNγ的产生水平分别为(17.67±3.31)U/L和(154.56±10.72)U/L,淋巴细胞增殖反应SI值为3.1;而注射PBS组不产生抗体,IL-2和IFNγ的产生水平分别为(1.17±0.21)U/L和(21.90±5.12)U/L,淋巴细胞增殖反应SI值为0.2。结果显示PG可明显增强HTNV-NP的免疫效果,且未出现不良反应,是良好的疫苗佐剂。     

2018-2019年云南省部分地区鼠类携带汉坦病毒基因型别分析

为了解云南省汉坦病毒的分子流行病学特征,本研究在云南省祥云县、泸西县、禄丰县和楚雄市4个地区布点,采集鼠类动物标本,运用实时荧光RT-PCR检测鼠肺标本中的汉坦病毒中的汉滩病毒和首尔病毒核酸,通过PCR扩增S节段的全基因序列,并进行核苷酸同源性分析和遗传进化分析。结果共捕获鼠类动物70份,包含10个鼠种,其中褐家鼠30只,占42.9%,其次是鼩鼱12只,占17.1%;核酸检测阳性标本19份,均为首尔病毒,检出率为27.1%,源自祥云县的标本检出率在四个地区中最高(32.0%)。从鼠肺标本中扩增得到8条汉坦病毒S节段全基因序列,相似性为87.0%~99.7%,遗传进化分析显示基因序列聚集形成2个分支,一个分支属于S1亚型,另一个分支在遗传进化分析和blast比对分析中与其他亚型同源性均小于90%,属首尔病毒中独立的新的遗传进化分支,提示了云南省鼠类动物间多基因亚型首尔汉坦病毒流行,应进一步关注由宿主动物溢出感染人的潜力。     

增加CpG基元的汉坦病毒核蛋白基因疫苗的免疫作用

以往的研究表明非甲基化胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸为基元构成的特定结构是一种很有希望的候选疫苗佐剂。为了研究增加CpG基元的汉坦病毒核蛋白基因疫苗的免疫作用,在本实验中,将重组真核表达质粒 pcDNA3.1 S(ISS)直接肌注免疫BALB/c 小鼠,分别用ELISA法检测血清特异性抗体的变化,MTT法检测 T细胞增殖反应,以及用ELISA kit检测免疫鼠脾细胞上清液中细胞因子IL 4和IFN γ的动态变化,从而了解免疫鼠的体液免疫反应和细胞免疫反应。结果显示 pcDNA3.1 S(ISS)接种组的小鼠血清抗体水平、T细胞增殖反应以及细胞因子IFN γ的产生水平较对照组 pcDNA3.1 S和空载体 pcDNA3.1 接种组的要高。而细胞因子 IL 4 较对照组却无明显变化。由此可见,增加CpG基元的质粒能够增强其所诱导的免疫反应,可用于那些需要借助强有力细胞免疫来清除病原体的疫苗研制中。     

汉坦病毒H8205株G1P基因片段重组杆状病毒表达载体的构建及表达

将汉坦病毒H8205株G1P基因的保守序列(约1000bp)作为目的基因插入到BactoBac杆状病毒表达系统的pFastBacHTb供体质粒中,利用Tn7转座子同BacmidDNA同源重组,获得了含目的基因片段的重组杆状病毒DNA,并利用其转染Sf9昆虫细胞,72h后收集细胞悬液,再用该悬液侵染Sf9昆虫细胞,48h后收获病毒.采用IFA分析收获的产物,观察到了特异性的荧光,并且采用SDSPAGE和Western印迹也获得了与预期一致的结果.证明感染后的Sf9昆虫细胞所表达的蛋白中含有能与抗汉坦病毒H8205株多克隆抗体特异性结合目的蛋白.研究表明,采用杆状病毒表达系统可以成功表达出汉坦病毒H8205株包膜糖蛋白G1基因片段,为开发适合的以G1P为抗原的汉坦病毒诊断试剂进行了前期的探索.