鱼类基因数据库与生物信息学在鱼类基因开发上的应用

近十年来,随着分子生物学技术的发展,各国际组织间的合作研究使得资源基因组计划得以普遍实施.各种动物、植物基因组数据库均在互联网上陆续发布,生物信息量随之迅猛增长,然而如何利用并发掘这些数据蕴涵的宝藏,从中提取解释生命个体生长发育、免疫调节以及病害控制等机理的宝贵信息,已成为人类所面临的巨大挑战.     

大麦转基因座位结构的研究

利用质粒营救法获得基因枪法转化的4种转绿色荧光蛋白基因(green fluorescent protein,GFP)大麦的转基因座位序列,序列分析显示4种材料的转基因座位中均有完整栽体的串联重复现象,表明转基因整合是同源重组的结果.同时转基因座位中也存在不完整载体片段、基因组片段的混杂排列,说明转基因整合时也发生异常重组.微粒轰击的转基因整合是由异常重组和同源重组共同完成的.     

染色体外同源重组结合细胞质注射途径研制转基因小鼠

以绵羊β-乳球蛋白基因(B—Lactoglobulin,β-LG)为转基因表达框架,将人G-CSF,(Human Granulocyte Colony Stimulating Factor,4G-CSF)基因与报告基因一增强型绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescenct Protein,EGFP)基因作为双表达单元拼接到口β-LG基因的第一外显子处,并在G-GSF基因两侧引入同源重组位点loxP、fox2272,将打靶基因表达构件β-LG-hG-GSF-IRES-EGFP(总长9．3kb)分为两段进行构建,片段Ⅰ(长5．9kb)与片段Ⅱ(长5．6kb)两段重叠部分为2．2kb。向小鼠受精卵细胞质共注射构件片段Ⅰ、Ⅱ和NLS(核定位信号)3个基因片段。对仔鼠进行整合与表达的检测。PCR-Southem杂交检测结果表明,片段I的整合率为62．3％(86／138),片段Ⅱ的整合率为54．3％(75／138),片段Ⅰ、Ⅱ共整合(包括两片段分别整合和染色体外同源重组两种情况)的小鼠为62只,整合率为44．9％(62／138),其中在双阳性转基因小鼠中发生染色体外同源重组的几率为80．6％(50／62)。RT-PCR-Southem检测了10只发生染色体外同源重组的转基因雌性小鼠,hG-GSF基因的表达率为90％(9／10),EGFP基因的表达率为100％(10／10),通过对其乳汁紫外吸收光谱的检测,EGFP基因的表达率为50％(5／10)。上述结果表明,染色体外同源重组结合细胞质注射技术研制转基因动物是简便实用的转基因途径。     

利用Red重组工程技术解决外源基因在大肠杆菌染色体lac操纵子中的表达

为了应用Red重组工程技术实现外源基因在大肠杆菌染色体上的表达, 寻找染色体上外源蛋白的稳定高效表达位点, 使用Red重组工程系统和kan/sacB无痕迹修饰技术, 将易于定量分析的荧光素酶报告基因替换DY330染色体lac操纵子中的lacZ基因。检测该位点的表达效率结果显示: 大肠杆菌染色体上lac操纵子能够高效稳定表达外源基因, 初步证明了染色体可以作为外源蛋白或抗原的表达载体, 不会影响细菌的生长繁殖。     

偶氮还原酶AZR的结构及其K109的定点突变研究

利用同源建模构建了Rhodobacter sphaeroides的偶氮还原酶AZR的三级结构模型, AZR为一种a/b型结构的黄素氧化还原蛋白。两类依赖黄素的偶氮还原酶的三级结构对比表明它们具有高度的相似性。在序列和结构对齐分析的基础上, 选择保守位点K109进行K109A和K109H的定点突变研究。突变后K109H的最适pH=6, 而K109A的最适pH=9。突变未改变AZR的最适温度(30℃)。第109位正电荷残基对甲基红的结合有重要影响; 而K109H对NADPH的结合并非保守突变。K109可能只参与对NADPH的2’-磷酸基团的结合, 而对NADH的结合无影响。     

Red系统三种蛋白在哺乳动物细胞核中定位表达的设计和构建

目的：构建在哺乳动物细胞核中同时定位表达Red系统三种蛋白的载体。方法：通过给red基因（gam、bet和exo）的3,端分别加入由7个氨基（pro—lys—lys—lys—Arg-Lys—Val）组成的核定位信号序列（nuclearlocalizationsignal,NLS）和4个甘氨酸构成的linker序列,再从入噬菌体基因组中,通过PCR技术分别扩增到C端均都带有NLS的gam、bet和exo的DNA全长序列,将三种PCR产物依次克隆入真核表达载体plRES2-EGFP中,得到含3个目的基因（gam—NLS、bet—NLs和exo—NLS）的三顺反子表达载体pCMV—gNIbNIxN,转染培养的哺乳类细胞后,用作者制备并纯化的抗Red3种蛋白的抗体进行间接免疫荧光检测,观察蛋白的定位情况。结果：不带有NLS的Red3种蛋白在细胞中表达主要集中在细胞质很少进入细胞核;而带有NLS的Red3种蛋白于不同时间转染人和鼠的两种细胞后,均表达定位于细胞核中。结论：三顺反子表达载体pCMV—gNIbNIxN的成功构建为进一步探索将λ噬菌体的red系统用于哺乳动物细胞的基因替代打下基础。     

金黄色葡萄球菌一氧化氮合酶基因(nos)缺失突变株的构建

目的：构建金黄色葡萄球菌一氧化氮合酶基因（nos）缺失突变株。方法从金黄色葡萄球菌RN6390的基因组DNA中扩增了nos基因的上、下游片段;以大肠杆菌和金黄色葡萄球菌穿梭质粒pMAD（含有温度敏感性的复制起点,红霉素抗性基因（erm）和B．半乳糖苷酶基因（bgaB）为筛选标记）为骨架,构建基于nos基因位点的同源重组载体pMADAnos,该载体经金黄色葡萄球菌RN4220修饰后再转入金黄色葡萄球菌RN6390。经过在30℃和42℃交替培养,通过抗生素抗性和β-半乳糖苷酶活性筛选nos基因缺失突变株。结果筛选得到的突变菌株,经基因组PCR、定量PCR及序列分析表明,金黄色葡萄球菌RN6390基因组中的nos基因被成功地敲除。结论利用同源重组的方法构建了金黄色葡萄球菌RN6390nos缺失突变株,为金黄色葡萄球菌nos基因功能的研究奠定了基础,     

Red重组系统用于大肠杆菌基因修饰研究进展

Red重组作为一种新的重组系统已经被广泛用于大肠杆菌的基因敲除、基因替换.与传统的Rec重组相比,Red重组具有同源臂短,重组效率高等优点.分别详细介绍了Red重组系统中Exo、Beta、Gam 3种蛋白质的功能,Red重组系统运用于大肠杆菌基因敲除的3种质粒及其功能,同时概括了Red重组的技术要点及技术难点,分析了文献报道的阿拉伯糖诱导浓度和诱导时间、转化后的复苏温度及时间、引物同源臂长度对于重组率的影响,总结出了Red重组的最佳条件.     

杉木CCoAOMT蛋白的生物信息学分析与同源模建

利用生物信息学方法分析了杉木CCoAOMT蛋白的氨基酸组成、等电点、疏水／亲水区、二级结构等蛋白质性质,并同欧洲云杉、拟南芥和水稻的蛋白进行了对比,并用生物信息学软件对其空间结构进行了模拟,同时对模建结果进行了结构质量的分析与检测。结果表明：该蛋白共有255个氨基酸,等电点为5．56,二级结构中α螺旋占37．65％,β折叠片占19．61％,无规卷曲占42．75％。三维结构检测表明此模型的结构符合立体化学规则。     

rBTI通过上调PTEN的表达抑制Hep G2细胞增殖

磷酸酶及张力蛋白的同源基因(PTEN) 是一种抑癌基因,可以调控细胞的增殖,与癌症的发生和发展息息相关。本研究采用MTT法和流式细胞术分别检测了重组荞麦胰蛋白酶抑制剂(rBTI)对人肝癌细胞株Hep G2细胞的增殖以及周期的影响。免疫荧光及Western印迹法检测了PTEN和p PTEN的亚细胞定位及蛋白表达的变化。采用qRT-PCR及Western印迹法检测了周期相关蛋白的表达。旨在探究PTEN和p PTEN在rBTI抑制Hep G2细胞增殖和周期阻滞中的作用。结果表明,rBTI能显著抑制Hep G2细胞增殖,将细胞周期阻滞在G0/G1期,并呈时间和剂量依赖性;rBTI作用于Hep G2后,可显著上调PTEN和p-PTEN的表达。同时发现,p-PTEN主要分布于细胞核中,能与核仁发生共定位;周期相关蛋白检测表明,细胞内p53、p21转录水平和蛋白水平均增加。综上所述,rBTI通过上调PTEN的表达,使得细胞周期阻滞于G0/G1期,进而抑制Hep G2细胞的增殖。