利用同源重组的方法提高大肠杆菌W3110天冬氨酸的积累

大肠杆菌中存在3种天冬氨酸激酶,分别为LysC,MetL,ThrA,使天冬氨酸磷酸化后分别进入Lys、Met、Thr的合成途径.因此大肠杆菌菌体中无法积累大量天冬氨酸. 以大肠杆菌W3110为出发菌株,利用Red同源重组系统分别构建了LysC、ThrA和MetL单基因缺陷株和LysC-ThrA和LysC-MetL双基因缺陷株. 采用高效液相色谱法测定L-天冬氨酸积累量. 发现除MetL单基因突变株外,其余突变株均积累了比野生型更多的L-天冬氨酸,这为代谢工程改造菌株并通过发酵法生产天冬氨酸奠定了基础.     

小菜蛾中肠氨肽酶基因PxAPN5的克隆、原核表达及蛋白质同源建模分析

【目的】克隆和表达小菜蛾Plutella xylostella氨肽酶基因,并进行基因序列分析和同源建模分析。【方法】以小菜蛾中肠cDNA为模板克隆分析氨肽酶基因序列, 原核表达氨肽酶蛋白并进行酶活性测定, 应用配体印迹分析氨肽酶与Cry2Ab蛋白的结合, 通过蛋白质建模对突变位点进行分析。【结果】从小菜蛾中肠cDNA 扩增出氨肽酶基因, 该基因全长2 853 bp, 编码950个氨基酸, 预测蛋白分子量为107.3871 kDa, 等电点为5.24; 进化树分析显示, 克隆得到的氨肽酶基因属于APN家族5, 将其命名为PxAPN5（GenBank登录号: KM034756）。PxAPN5蛋白具有鳞翅目昆虫氨肽酶蛋白的保守性特征, 即含有N-糖基化位点、O-糖基化位点和GPI锚定位点, 具有“HEXXH”锌蛋白酶结构域和C端跨膜区域。在大肠杆菌Escherichia coli中原核表达PxAPN5, 表达产物经SDS-PAGE电泳, 在110 kDa附近出现特异性条带; 酶活性测试显示菌体破碎上清液具有氨肽酶活性, 比活力为1 047.2 U/g。配体印迹结果显示表达的PxAPN5能与Cry2Ab蛋白特异性结合。多序列比对结果表明, 与其他已报道的小菜蛾氨肽酶相比, PxAPN5氨基酸序列有3个保守性位点发生了突变,并通过蛋白质建模的方式表征突变位点。【结论】本研究成功克隆和表达了具有氨肽酶活性的小菜蛾氨肽酶, 并发现其能与Cry2Ab蛋白特异性结合; 通过蛋白质建模对氨肽酶突变位点的特征及功能进行了预测。 这些结果对小菜蛾氨肽酶的功能性研究提供了理论基础。     

蒺藜苜蓿花器官特异基因的表达分析

蒺藜苜蓿(Medicago truncatula G.)花器官特异表达基因是参与其花器官形成与发育的重要基因。筛选蒺藜苜蓿的花器官特异表达基因, 寻找这类基因在其他模式植物中的直系同源基因, 并将其表达模式在不同植物间进行比较, 有利于深入的理解这类基因在蒺藜苜蓿花器官发育中的功能。根据蒺藜苜蓿表达谱, 并以其PISTILLATA(PI)基因为模板, 文章筛选了97个蒺藜苜蓿花器官特异表达基因(Ratio≥10, 且Z≥7.9)。通过同源比对, 确定了这类基因在拟南芥(Arabidopsis thaliana L.)、大豆(Glycine max L.)、百脉根(Lotus japonicus L.)和水稻(Oryza sativa L.)中的直系同源基因。对这类基因在5种植物中的表达量、表达部位和功能进行比较, 发现进化关系较近的植物, 直系同源基因的表达变异较小, 而进化关系较远的植物, 直系同源基因的表达变异较大。进一步对表达分化较大的直系同源基因进行启动子分析, 发现不同植物中直系同源基因表达模式的变化与启动子中调控元件的特性有关。     

构建胸膜肺炎放线杆菌apxIC基因插入突变株

目的：构建胸膜肺炎放线杆菌（APP）apxIC基因插入突变菌株,以鉴定ApxⅠ毒素的生物学特性。方法：根据apxⅠ核酸序列（U05042）设计1对引物,用于自APP血清10型参考菌株（D13039）基因组DNA中扩增apxIC基因及其上下游约2．8kb的基因片段,经克隆测序后在apxIC基因下游xbI酶切位点处插入约0．9kb的氯霉素（Chl）抗性基因表达盒,构建用于转化的转移载体pUIC-Chl^r,将转移载体DNA经电转化导入APP血清10型参考菌株中进行同源重组,以获得突变菌株。结果：在含有氯霉素的培养基中经筛选获得2株丧失溶血活性的突变菌株（D13039C-Chl^r）;利用PCR和Southern blot对突变菌株鉴定,显示氯霉素抗性基因已被插入细菌基因组中。结论：利用电转化和同源重组技术构建成功APP apxIC基因插入突变菌株,为分析ApxⅠ毒素的生物学特性,进而研制APP基因工程减毒活疫苗奠定了基础。     

亚麻中雄性不育基因同源序列MS2-F的克隆和表达分析

用同源序列克隆法从亚麻中克隆了雄性不育基因同源序列MS2-F cDNA(登陆号:EU363493).该cDNA全长1 91lbp,包含一个1 608 bp的ORF,编码535个氨基酸.推导的蛋白质序列中包含2个雄性不育保守区:NAD结合区域和雄性不育C-末端区域.该基因与油菜和拟南芥雄性不育基因的一致性分别为59.65%和59.16%,为花蕾特异表达基因,推测在亚麻花粉发育过程中与脂酰辅酶A还原酶有相似功能.MS2-F cDNA对应的gDNA大小为2 696 bp(登陆号:EU365361),含有8个内含子和9个外显子.     

IGF-1基因产物的结构和功能多样化

胰岛素样生长因子-1(IGF-1)基因包含6个外显子,具有转录和翻译产物多样化的特点,原因在于存在多个转录起始位点的选择性应用,转录产物的选择性剪接,以及不同多聚腺苷酸化位点的使用.长期以来人们普遍关注由外显子3和4编码的循环型IGF-1在生长发育中的作用,最近对肌肉、神经等组织自分泌/旁分泌的局部型IGF-1研究发现,选择性剪接产生的IGF-1变体具有外显子5和6编码的延伸肽(E肽),并表现出特殊的生物学功能,如IGF-1Ea、IGF-1Eb(MGF)及其E肽在骨骼肌、心肌、神经等组织中表现出促进生长和损伤修复的功能,这些特殊功能可能通过细胞表面的一种特殊E肽受体介导.     

利用Red重组工程技术解决外源基因在大肠杆菌染色体lac操纵子中的表达

为了应用Red重组工程技术实现外源基因在大肠杆菌染色体上的表达, 寻找染色体上外源蛋白的稳定高效表达位点, 使用Red重组工程系统和kan/sacB无痕迹修饰技术, 将易于定量分析的荧光素酶报告基因替换DY330染色体lac操纵子中的lacZ基因。检测该位点的表达效率结果显示: 大肠杆菌染色体上lac操纵子能够高效稳定表达外源基因, 初步证明了染色体可以作为外源蛋白或抗原的表达载体, 不会影响细菌的生长繁殖。     

鱼类基因数据库与生物信息学在鱼类基因开发上的应用

近十年来,随着分子生物学技术的发展,各国际组织间的合作研究使得资源基因组计划得以普遍实施.各种动物、植物基因组数据库均在互联网上陆续发布,生物信息量随之迅猛增长,然而如何利用并发掘这些数据蕴涵的宝藏,从中提取解释生命个体生长发育、免疫调节以及病害控制等机理的宝贵信息,已成为人类所面临的巨大挑战.     

大麦转基因座位结构的研究

利用质粒营救法获得基因枪法转化的4种转绿色荧光蛋白基因(green fluorescent protein,GFP)大麦的转基因座位序列,序列分析显示4种材料的转基因座位中均有完整栽体的串联重复现象,表明转基因整合是同源重组的结果.同时转基因座位中也存在不完整载体片段、基因组片段的混杂排列,说明转基因整合时也发生异常重组.微粒轰击的转基因整合是由异常重组和同源重组共同完成的.     

染色体外同源重组结合细胞质注射途径研制转基因小鼠

以绵羊β-乳球蛋白基因(B—Lactoglobulin,β-LG)为转基因表达框架,将人G-CSF,(Human Granulocyte Colony Stimulating Factor,4G-CSF)基因与报告基因一增强型绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescenct Protein,EGFP)基因作为双表达单元拼接到口β-LG基因的第一外显子处,并在G-GSF基因两侧引入同源重组位点loxP、fox2272,将打靶基因表达构件β-LG-hG-GSF-IRES-EGFP(总长9．3kb)分为两段进行构建,片段Ⅰ(长5．9kb)与片段Ⅱ(长5．6kb)两段重叠部分为2．2kb。向小鼠受精卵细胞质共注射构件片段Ⅰ、Ⅱ和NLS(核定位信号)3个基因片段。对仔鼠进行整合与表达的检测。PCR-Southem杂交检测结果表明,片段I的整合率为62．3％(86／138),片段Ⅱ的整合率为54．3％(75／138),片段Ⅰ、Ⅱ共整合(包括两片段分别整合和染色体外同源重组两种情况)的小鼠为62只,整合率为44．9％(62／138),其中在双阳性转基因小鼠中发生染色体外同源重组的几率为80．6％(50／62)。RT-PCR-Southem检测了10只发生染色体外同源重组的转基因雌性小鼠,hG-GSF基因的表达率为90％(9／10),EGFP基因的表达率为100％(10／10),通过对其乳汁紫外吸收光谱的检测,EGFP基因的表达率为50％(5／10)。上述结果表明,染色体外同源重组结合细胞质注射技术研制转基因动物是简便实用的转基因途径。