美国黑核桃SSR反应体系优化

优化SSR-PCR反应体系是黑核桃（Juglans nigra L.）SSR基因鉴定和群体遗传等研究的基础。本研究通过对PCR反应中Mg²⁺浓度、牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin,BSA）浓度、Taq聚合酶用量、dNTPs浓度、引物浓度和模板DNA量的组合以及PCR程序组合试验,确定了黑核桃SSR的最佳反应体系,即在10 μL的PCR反应体系中,含10 ng模板DNA,0.1 mg·mL^-1牛血清蛋白（BSA）,0.25 mmol·L^-1 dNTPs,1.5 mmol·L^-1 Mg²⁺ 1 μL 10X Taq DNA聚合酶反应缓冲液,0.5 U Taq聚合酶,1.0 mmol·L^-1单对引物（0.5 mmol·L^-13对引物）。SSR-PCR反应扩增程序为：94℃变性3 min;93℃变性15 s,50℃或者53.5℃退火1 min,72℃延伸30 s,32个循环;72℃后延伸10 min,置4℃保存。利用此反应体系对黑核桃进行PCR扩增并电泳检测,其结果清晰、稳定、可靠,适合进一步对黑核桃群体遗传、基因型鉴定和分子生态研究。     

微卫星DNA检测方法的研究

在检测牙鲆的微卫星变异时,对聚丙烯酰胺凝胶的种类、浓度及其银染方法进行了优化.实验总结了一套适用于微卫星检测的方法.该方法具有灵敏度高、凝胶透明度高、对环境污染小、条带清晰和染色时间短等特点,能显著提高检测分辨率,具有广泛的推广价值.     

金华猪遗传结构及其与太湖猪遗传分化的研究

本研究利用65个微卫星标记结合荧光标记检测技术, 对金华猪I系、II系、III系共271个个体以及嘉兴黑猪、中梅山猪、小梅山猪和二花脸猪等4个太湖猪品种和嵊县花猪各30头的基因型进行了检测, 统计分析了金华猪各品系的遗传结构及各猪种群间的遗传分化。结果显示: 金华猪品系间具有丰富的遗传变异, 平均有效等位基因数以金华猪I系最高, 为3.5; 其次是II系和III系, 分别是2.8和2.5, 金华猪3个品系的平均多态信息含量均高于0.5; I、II、III系的平均观察杂合度分别是0.381、0.399和0.442。金华猪3个品系偏离Hardy-Weinberg平衡的程度不一:I系偏离较大, III系次之, II系相对较小。分析认为金华猪各品系存在一定程度的近交, 品系间存在不同的等位基因。遗传分化结果显示: 金华猪II系和III系间遗传分化相对较小(F_ST＝0.1883), 但它们与I系间的遗传分化较大, F_ST值分别是0.3663和0.3619。同时, 金华猪各品系与太湖猪的遗传关系较近, 其中与中梅山猪群体遗传分化相对较小, F_ST值分别为0.3581、0.3560和0.3572。而金华猪各品系与嵊县花猪的遗传分化最大, F_ST值分别为0.4499, 0.4654和0.4801, 由此可见, 金华猪不同于其他浙江省地方品种, 有着独立的起源和驯化进程。     

利用回交导入系剖析水稻苗期和分蘖期耐盐性的遗传重叠

以籼稻品种IR64为受体,来自伊朗的粳稻农家品种Binam为供体培育的99个BC2F8回交导入系为材料,定位了水稻在2叶1心期和分蘖期控制耐盐相关性状的数量性状基因座（QTL）．共检测到影响苗期叶片盐害级别、幼苗存活天数和地上部钾、钠离子浓度的QTL 13个,影响分蘖期株高、分蘖数和地上部鲜重的QTL 22个．多数分蘖期QTL对盐胁迫表现出明显的表达差异,根据表达情况将这些QTL分成3组,第1组为在对照条件下表达的11个QTL;第2组为在对照和盐胁迫条件下共同表达的5个QTL,其中有3个（QPh5,QPh8,QTn9）在两种环境下的基因效应大小和方向一致,其表达受盐胁迫影响较小;第3组为受盐胁迫诱导表达的6个QTL．检测到13个影响胁迫与对照差值即性状稳定性的QTL,除QPh4,QTn2和QFw2a外,其余10个基因座增加性状稳定性或提高耐盐性的等位基因均来自Binam．上述受盐胁迫影响较小的3个QTL和影响性状稳定性的13个QTL对耐盐性有贡献,属耐盐QTL．比较苗期和分蘖期耐盐QTL的分布,发现多数（69％）影响苗期和分蘖期的耐盐QTL在遗传上相互独立,仅在第1,2,8和11染色体的4个相同或相邻区域定位到影响两个时期的耐盐QTL,表明苗期和分蘖期的耐盐性存在部分的遗传重叠．通过标记辅助选择将苗期和分蘖期的重要耐盐QTL进行累加,或针对苗期和分蘖期的重叠耐盐QTL进行选择,有可能培育出苗期和分蘖期均耐盐的水稻品种．     

大黄鱼肌肉生长抑制素基因微卫星序列多态性分析

肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)参与肌肉生长和脂肪发生的调节．本研究在克隆大黄鱼MSTN cDNA的基础上,对3′端非编码区微卫星序列的多态性及其与体长、体重和肌肉脂肪含量的关系进行了分析．结果表明,获得的cDNA长1 886 bp,在3′端非编码区存在微卫星序列（CA）_n．在受检的52个个体中,微卫星序列长度在64～126 bp之间.大部分个体的微卫星序列内存在碱基替换,最常见的碱基替换形式是C→T,属于非完美型微卫星序列．根据该位点微卫星序列长度,在实验群体中共检测到23个等位基因,其中频率为0.019 2的等位基因11个,0.038 5的5个, 0.076 9的3个,0.057 7的2个,0.115 4和0.134 6的各1个．该基因位点的群体杂合度为0.932 7,多态信息含量为0.928 8．微卫星序列长度与大黄鱼体长、体重和肌肉脂肪含量之间的相关系数分别为0.409、0.435和-0.026,P值分别为0.021、0.016和0.878．碱基替换对大黄鱼生长及肌肉脂肪含量均无显著影响．     

高频度微卫星不稳定性大肠癌"修饰型"微卫星变化与MLH1及KRAS基因突变密切相关

本研究通过方法学的改良和观察方式的创新试图阐明这种现象的原因.微卫星非传统的检测方法仅能实现微卫星定性检测,我所在的研究组开发了自动片段分析双荧光标识技术,提高了微卫星检测的感度和重复性,并实现了微卫星片段变化长度的定量.小于6碱基的微卫星变化被定义为修饰型微卫星不稳定,大于8碱基的变化被定义为跳跃型微卫星不稳定,它们的电泳谱截然不同.前者表现为在非肿瘤来源微卫星位点基础上的增加或减少,后者表现为距离非肿瘤微卫星片段远隔部位的新波形的出现.通过研究我们发现,在DNA错配修复缺陷细胞系及基因敲除大鼠自发肿瘤样本,仅有修饰型微卫星不稳定性检出;在人类DNA错配修复缺陷细胞系连续80次传代也没有检出跳跃型变化.跳跃型变化不能通过简单重复序列不稳定基础上的增加或减少的累加而获得.在76例散发大肠癌,我们检测了微卫星不稳定性,KRAS基因突变,并对高频度微卫星不稳定性病例的两个主要DNA错配修复基因MSH2和MLHl进行了全长测序.我们发现,在大肠癌,按频度的传统分类与按波形变化的分类有高度的一致性,高频度微卫星不稳定性病例均检测到跳跃型表现,低频度微卫星不稳定性都表现为修饰型变化.在12例高频度微卫星不稳定病例,有三例检出了跳跃型和修饰型同时存在微卫星不稳定的特殊表型,这3例均检出KRAS的突变,更有趣的是该3例病例也同时检出了DNA错配修复基因MLH1的变异.而在其他9例高频度微卫星不稳定病例,KRAS突变及MLH1、MSH2交变未检出.通过对突变谱的分析我们还发现,修饰型微卫星不稳定与KTAS基因12号密码子的转换型突变高度相关,而微卫星稳定的病例检出的KRAS基因12号密码子突变多为颠换型突变.修饰型微卫星不稳定表型检出的高频度转换突变可由DNA错配修复缺陷的分子背景解释.通过本研究,我们认为以波形为基础的微卫星不稳定新分型可能是解决目前微卫星研究领域矛盾的一个选项.一直公认为高频度微卫星不稳定性是"真正"的DNA错配修复缺陷表型,我们的研究提示实际上高频度微卫星的可能是多元的.修饰型微卫星不稳定与DNA错配修复缺陷直接关联,而跳跃型微卫星不稳定的原因尚未阐明.在高频度为微型不稳定中,携带修饰型变化的病例可以通过DNA错配修复系统缺陷来解释其病因.     

直结肠癌BUBR1的过度表达与TP53突变及微卫星状态关系提示其过度表达与染色体不稳定表型有关

在有丝分裂过程中BUBR1监视微管与着丝点的结合,是保证染色体均等分离的重要分子机制之一.BUBIB变异家谱研究及其敲除模型的研究表明,BUBR1缺陷与染色体不稳定性及肿瘤的发生直接相关.近来在数种人类肿瘤,对BUBR1蛋白过度表达有所报道.但在直结肠癌,BUBR1的过度表达是否与染色体不稳定性的发生有关目前仍无定论.在人类结直肠癌的遗传不稳定性主要表现为两种类型,染色体不稳定性及微卫星不稳定性,它们提示了两条独立的肿瘤发生路径.一般认为不存在高频度微卫星不稳定性表型的肿瘤通过染色体不稳定途径癌变.P53蛋白通过多种机制对维护遗传稳定性起到重要的作用,TP53基因突变经常与染色体不稳定现象并存.DNA倍体情况也是染色体不稳定研究不可缺少的指标.本研究采用免疫组织化学法检测了一组93例进展期散发结直肠癌BUBR1蛋白的表达情况,直接测序法检测TP53变异.高分辨率荧光标记微卫星不稳定检测技术检测微卫星状态,固相激光扫描细胞仪技术检测DNA倍体情况.我们分析了BUBR1表达与三种反映遗传背景的因子的关系.BUBR1蛋白过度表达在人结直肠癌较为常见.在非高频度微卫星不稳定的结直肠癌,BUBR1蛋白过度表达率明显为高(P＜0.01),在TP53基因突变的病例其过度表达率亦较高(P＜0.05).BUBR1蛋白的过度表达与DNA异倍体无统计学相关,但DNA异倍体病例的BuBRl过度表达有偏高倾向.BuBRl表达情况与常用的临床病理学指标无统计学相关.BuBRl过度表达同微卫星状态及TP53突变的关系明确的提示,在人类散发结直肠癌,BUBR1蛋白过度表达与染色体不稳定状态有关.BUBR1过度表达作为一种常见的分子异常,对于肿瘤的早诊预防提供新的标志物.并可能成为治疗的新靶点.     

Microsatellite analysis of genetic diversity and population structure of Chinese mitten crab （Eriocheir sinensis）

Chinese mitten crab (Eriocheir sinensis) has higher commercial value as food source than any other species of Eriocheir in China.To evaluate the germplasm resources and characterize the genetic diversity and population structure of the crabs in different water systems,two stocks and two farming populations were assessed with 25 polymorphic microsallite loci available in public GenBank.Basic statistics showed that the average observed heterozygosity (Ho) amongst populations ranged from 0.5789 to 0.6824.However,a remarkable presence of inbreeding and heterozygote deficiencies were observed.To analyze population structure,pairwise FST coefficients explained only ～10.3% variability from the subdivision of mitten crab populations,the remaining variability stems from the subdivision within subpopulations.Although the four populations had slight differentiation,different allelic frequencies resulted in distinct population structures.Two stocks and one farming population were clustered together to the phylogenetic branch of Yangtze crab,with an approximate membership of 95%.Whereas,another fanning population was clustered singly to the phylogenetic branch of the Liaohe crab,with a membership of 97.1%.The tests for individual admixture showed that Yangtze crab had probably been contaminated with individuals from other water systems.Genetic relationships between populations also supported the conclusion that Yangtze crab and Liaohe crab had different gene pools in spite of the origins of the same species.     

The analysis of genetic diversity and differentiation of six Chinese cattle populations using microsatellite markers

A total of 321 individuals from six cattle populations of four species in a bovine subfamily in China were studied using 12 pairs of microsatellite markers. The genetic diversities within and between populations were calculated. The phylogenetic trees were constructed by （δμ）^2 and DA distances, and the divergence times between populations were estimated by （δμ）^2. Altogether, 144 microsatellite alleles were detected including 24 private alleles and nine shared alleles. Chinese Holstein had the largest number of private alleles （10）, whereas Bohai black and Buffalo had the smallest number of private alleles （2）. Chinese Holstein showed the highest genetic variability. Its observed number of alleles （Na）, mean effective number of alleles （MNA）, and mean heterozygosity （He） were 7.7500, 4.9722, and 0.7719, respectively, whereas, the Buffalo and Yak showed low genetic variability. In the phylogenetic trees, Luxi and Holstein grouped first, followed by Bohai and Minnan. Yak branched next and buffalo emerged as the most divergent population from other cattle populations. Luxi and Bohai were estimated to have diverged 0.039-0.105 million years ago （MYA）, however, buffalo and Holstein diverged 0.501-1.337 MYA. The divergence time of Yak versus Minnan, Holstein and buffalo was 0.136-0.363, 0.273-0.729, and 0.326-0.600 MYA, respectively.     

微卫星DNA聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)银染法的改良

为了筛选和检测绵羊种群中具有较好表现的微卫星多态性,采用Touch-down PCR方法扩增绵羊基因组上的微卫星DNA序列后,经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,采用改良的银染法对微卫星位点进行多态性检测,染色结果与常规银染法相比,该方法具有灵敏度高、背景浅、污染小、条带清晰等突出特点,能有效地控制染色背景,显著提高检测分辨率,整个染色过程所需时间短,具有广泛的推广价值。