酵母双杂交系统筛选与RapGAP相互作用的蛋白质

目的筛选与Rap GAP相互作用的蛋白质,为进一步研究人源Rap1GAP介导的信号转导通路、揭示其与肿瘤的关系提供实验依据。方法选用与Rap1GAP同源的来自美丽线虫的Rap GAP作为饵蛋白,以来源于美丽线虫的c DNA文库作为靶蛋白,应用p PC97、p PC86组成的酵母双杂交系统筛选c DNA文库中与Rap GAP相互作用的蛋白质。结果通过营养缺陷平板(-LTH)筛选出63个拟似阳性菌落。经过Lac Z鉴定,19个菌落为阳性,其中7个为强阳性。提取来自19个酵母菌落中的重组DNA,经PCR扩增,12个菌落出现阳性结果。将该19个重组DNA分别电转化入DH5α细菌,涂板培养后,每板挑取4~10个克隆,通过Sal I和Not I双酶切鉴定进行阳性克隆筛选。将阳性克隆的重组DNA进行序列测定。测序结果与Gen Bank比较,其中4个克隆的DNA片段为Y39b6a基因片段、2个为Rap GAP、1个为苯丙氨酸-4-羟化酶、1个为细胞色素C氧化酶,还有1个DNA片段编码美丽线虫特有的小分子蛋白的基因片段,其余11个DNA片段不编码已知蛋白质。结论初步筛选出与Rap GAP相互作用的蛋白质,特别是其中有2个克隆为Rap GAP,提示Rap GAP可能以二聚体的方式存在。     

环指蛋白RING1与A型核纤层蛋白的细胞内相互作用

环指蛋白RING1能结合DNA并抑制基因的转录.采用酵母双杂交方法从人骨骼肌文库中筛选出了与A型核纤层蛋白(lamin A)结合的RING1蛋白,回复杂交酵母能在缺陷培养基上生长.RING1与绿色荧光蛋白融合载体转染HEK293细胞,激光共聚焦显微观察发现RING1能与带红色荧光蛋白的lamin A蛋白在细胞核周围共定位.免疫共沉淀结果证明RING1与lamin A能够相互作用.结果证明了一个新的lamin A结合蛋白,为揭示lamin A影响基因表达乃至细胞衰老提供了依据.     

盐藻酵母双杂交诱饵载体的构建及自激活鉴定

构建用于杜氏盐藻核基质结合区结合蛋白(matrix attachment region binding protein,MBP)酵母双杂交试验的诱饵栽体,进行自激活及毒性验证.以含有盐藻MBP质粒为模板,经PCR扩增后连接pMD 18-T栽体,经测序鉴定正确后,EcoR Ⅰ/Nde Ⅰ双酶切获得目的基因MBP,克隆入经同样双酶切的酵母栽体pGBKT7,转化酵母菌株AH109及Y187,检测其自激活以及毒性.结果显示,成功扩增出盐藻MBP基因,重组质粒pGBKT7-MBP经酶切、测序表明序列正确,转化酵母菌株无自激活,无毒性.     

TSA1 interacts with CSN1/CSN and may be functionally involved in Arabidopsis seedling development in darkness

The COP9 signalosome (CSN) is a multiprotein complex which participates in diverse cellular and developmental processes.CSN1,one of the subunits of CSN,is essential for assembly of the multiprotein complex via PCI (proteasome,COP9 signalosome and initiation factor 3) domain in the C-terminal half of CSN 1.However,the role of the N-terminal domain (NTD) of CSN 1,which is critical for the function of CSN,is not completely understood.Using a yeast two-hybrid (Y2H) screen,we found that the NTD of CSN1 interacts with TSK-associating protein 1 (TSA1),a reported Ca2+-binding protein.The interaction between CSN1 and TSA1 was confirmed by co-immunoprecipitation in Arabidopsis.tsal mutants exhibited a short hypocotyl phenotype in darkness but were similar to wild-type Arabidopsis under white light,which suggested that TSA1 might regulate Arabidopsis hypocotyl development in the dark.Furthermore,the expression of TSA1 was significantly lower in a csnl null mutant (fus6),while CSN1 expression did not change in a tsal mutant with weak TSA1 expression.Together,these findings suggest a functional relationship between TSA1 and CSN1 in seedling development.     

酵母双杂交系统的发展及其衍生系统的比较

酵母双杂交及其衍生系统是鉴定及分析蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA、蛋白质-RNA相互作用的最常用、最有效的工具之一。本文系统介绍了该技术的背景、发展过程,以及由Fields和Song初次描述的由酵母双杂交系统衍生而来的几种主要的双杂交系统的特点,并简要比较了各系统的优缺点。     

小鼠P311蛋白与类赖氨酰氧化酶-1相互作用的鉴定

P311是利用抑制差减杂交技术从小鼠肺组织中筛选到的一个肺泡发育上游调节基因.它高水平表达于肺泡发育的相关阶段,而在慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)患者肺组织中表达水平大大下降.为深入探讨P311蛋白的作用机制,构建pGBKT7-P311诱饵表达载体,利用酵母双杂交技术,从小鼠肺组织cDNA文库中筛选出P311相互作用蛋白类赖氨酰氧化酶-1(lysyl oxidase-like 1,Loxl-1).并通过体内外免疫共沉淀及双分子荧光互补实验进行验证.为进一步研究P311蛋白的生物学功能提供新的思路。     

香蕉红素氧还蛋白基因在酵母双杂交系统中的自激活检测

利用PCR方法扩增香蕉红素氧还蛋白基因的保守结构域序列CdRD和开放性阅读框序列FRD,并在其上下游分别引入NdeⅠ和SalⅠ酶切位点,双酶切后与同样经NdeⅠ和SalⅠ双酶切的诱饵质粒载体pGBKT7连接,构建重组诱饵质粒pGBKT7-CdRD和pGBKT7-FRD,并将此两重组诱饵质粒转入酵母菌株AH109中进行营养缺陷型分析检测毒性及自激活。结果表明,成功构建了重组诱饵质粒pGBKT7-CdRD和pGBKT7-FRD,并且其无自激活报告基因作用,对酵母菌株也无毒性作用。这说明此两个重组诱饵质粒可用于酵母双杂交系统,为从香蕉叶片cDNA文库中筛选获得与香蕉红素氧还蛋白基因的保守结构域序列CdRD和开放性阅读框序列FRD相互作用的受体蛋白基因奠定了基础。     

Nogo-B与Clusterin结合对细胞凋亡的影响

神经轴突生长抑制因子Nogo—B在体分布广泛,提示其除了具有抑制中枢神经系统轴突再生作用外,可能还扮演其他重要的功能角色。该研究为探讨Nogo-B下游新的结合分子及其功能开展相应研究。通过设计诱饵蛋白筛选人脑cDNA文库、免疫共沉淀方法,寻找Nogo-B下游结合分子：通过流式细胞术,检测结合对于细胞凋亡的影响：通过绿色荧光蛋白标记和免疫组织化学方法,探讨Nogo-B诱导细胞凋亡的机制。结果提示,Clusterin除了与Nogo-66功能域在酵母双杂交系统中存在结合,与Nogo—B在哺乳细胞中也能发生结合。过表达Nogo-B可明显诱导HEK293细胞凋亡,与Clusterin共表达可下调早期细胞凋亡率,但后期Nogo—B可通过调节Clusterin由胞浆到胞核转位,进一步诱导细胞凋亡进程。该研究首次提出Nogo—B与Clusterin之间存在结合,且结合参与了Nogo-B诱导的细胞凋亡进程。     

利用酵母双杂交系统筛选水稻类受体激酶OsWAK50胞内域相互作用蛋白

细胞壁连接的类受体激酶(wall-associated kinase,WAK)是植物细胞中一类特有的类受体激酶基因亚家族,因其胞外域与细胞壁紧密相连而得名．水稻中共有125个OsWAK基因,OsWAK50编码的蛋白质具有胞外域、跨膜域和激酶域,呈现典型的WAK样受体激酶特征．首先通过对OsWAK50-GFP融合蛋白的观察发现OsWAK50定位于细胞膜并且与细胞壁偶联．进而通过酵母双杂交系统筛选到了20个可能与OsWAK50胞内域相互作用的候选蛋白,并通过一对一酵母转化验证了OsSK4、OsSWIB和OsSWI3C全长均可与OsWAK50胞内域相互作用．进一步分析显示,OsSWIB能够直接与OsWAK50激酶域互作,而OsSK4和OsSWI3C与OsWAK50胞内域的互作是依赖于OsWAK50 C端的．研究还表明,OsSK4和OsSWIB亦能与OsWAK50同源基因OsWAK53a结合,而OsSWI3C则不能与OsWAK53a结合．双分子荧光互补实验证明,OsSK4与OsWAK50和OsWAK53a能够在植物体内发生互作．以上结果为阐明OsWAK50发挥功能的分子机制提供了重要线索．     

PML coiled-coil结构域与RAN结合蛋白9相互作用的验证

目的验证前髓细胞性白血病的卷曲螺旋结构域（PML—C）和RAN结合蛋白9（RANBP9）之间的相互作用。方法构建分别表达诱饵蛋白PML—C和靶蛋白RANBP9的载体pGBKT7-PML-C和pACT2-RANBP9,然后转人酵母AH109,培养3～5d后对其是否有胞内相互作用进行检测。将目的片断PML-C和RANBP9再次构建于真核生物表达载体pCMV—HA和pCMV—myc里,然后共转染人胚肾293细胞里（HEK293）,最后对其是否有体外相互作用通过免疫共沉淀和免疫印迹进行分析。结果在共转化了质粒pGBKT7-PML—C和pACT2-RANBP9的AH109酵母平板里观察到蓝色菌落生长。用抗HA多克隆抗体对共转染过重组质粒的HEK293细胞的蛋白提取物进行免疫共沉淀,再用抗myc单克隆抗体作为一抗进行免疫印迹,最终检测出融合蛋白myc—RANBP9条带。结论酵母双杂交实验验证了PML—C和RANBP9之间存在胞内相互作用,同时免疫共沉淀实验也从体外验证了它们之间的相互作用。