不同培养条件对悬浮培养茶叶细胞生长及茶氨酸合成的影响*

婺源绿茶嫩叶用MS 培养基( 加IBA 2 mgPL, 6-BA 4 mgPL) 进行茶叶愈伤组织悬浮培养, 研究了不同培养条件对茶叶细胞悬浮培养过程中细胞生长与茶氨酸合成的影响。结果显示, NH4+PNO3- 110P6010 mmolPL、K+ 10010 mmolPL、Mg2+ 310mmolPL、H2PO4- 310 mmolPL、蔗糖3010 gPL、水解酪蛋白210 gPL 条件下, 茶叶细胞生长量和茶氨酸积累量均达到最高值; 提高培养基中蔗糖和水解酪蛋白浓度可使细胞对数生长期和稳定期得到延长, 从而有利于茶氨酸积累; H2 PO4- 浓度主要影响细胞生长速率和茶氨酸积累速率的同步性, 低H2 PO4- 浓度环境中茶氨酸积累速率峰值滞后于细胞增长速率峰值, 高H2PO4- 浓度环境中早于细胞生长速率峰值出现时间; K+ 和Mg2+ 对细胞生长的影响不明显, 但影响细胞茶氨酸合成酶活性, 维持适量的K+和Mg2+ 有利于茶氨酸积累。添加盐酸乙胺可大幅度提高茶氨酸积累量, 并且先加入一定量盐酸乙胺再每天进行少量补充, 茶氨酸合成量比一次性加入的效果要好。茶叶细胞生长和茶氨酸积累高峰期在整个培养过程的第19~ 22 天出现, 从生产效率考虑, 培养周期以19~ 22 天为宜。     

高效的多巴胺能神经元原代培养方法及其影响因素的研究

目的：建立一种简单高效的中脑多巴胺神经元细胞原代培养方法,并观察胰酶消化对中脑多巴胺能神经元突起生长的损伤作用。方法：以Nakai等经典神经元细胞原代培养方法为基础,通过使用低日龄胎鼠,初次培养液加入胎牛血清等步骤,促进中脑多巴胺能神经元细胞贴壁和生长;在无胰酶消化组直接使用内口外翻的小口径硅化吸管轻柔吹打离散细胞,比较两种方法间神经元细胞突起形成的差异。结果：接吹打组其多巴胺能神经元细胞突起的生长程度（2124-10um）明显高于胰酶消化组（113＋9μm）（P〈0．01）,而两组间多巴胺阳性细胞比例未见显著差异（P〉0．05）。结论：在中脑多巴胺能神经元细胞原代培养中,低日龄胎鼠及免胰酶消化离散细胞可减少神经元细胞损伤,有利于细胞突起的生长。     

Balb/C乳鼠小脑Purkinje细胞原代培养方法

目的建立一种简单、有效的Balb/C乳鼠小脑Purkinje细胞原代培养方法,并初步研究其细胞电生理特性。方法钝性分离生后24h内的乳鼠小脑,采用低浓度胰蛋白酶加机械吹打法获得单细胞悬液,然后用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养,24h候更换为1%N2+1%T3+1%谷氨酰胺的DMEM/F12维持培养,3-5d天后进行细胞免疫荧光染色,7-9d天后用全细胞膜片钳单通道法记录钙电流。结果该方法培养的神经元形态典型,细胞学鉴定阳性率高(70%),并能记录到钙通道电流。结论该方法取材容易,操作简便,且培养出的原代Purkinje细胞生长状态较好,神经元的活性较高,可用于电生理研究。     

液体悬浮培养条件下发菜细胞的光合速率与呼吸速率

用液相氧电极测定离体悬浮生长发菜细胞的光合速率和呼吸速率的结果表明,发菜细胞的光补偿点为15￣16μmol·m-2·s-1,光饱和点为90μmol·m-2·s-1,光抑制点为190μmol·m-2·s-1。25℃下发菜细胞光合速率最高,呼吸速率则在10￣50℃范围内随温度升高而增强。发菜细胞光合作用的最适pH值为7.0￣7.5,呼吸作用最适pH值为9.0。BG110无氮培养基中添加30mmol·L-1NaNO3,发菜细胞的光合速率增加约20%。培养基中Na2HPO4浓度为1.75mmol·L-1时,细胞光合速率和呼吸速率最大,随后保持稳定。钾盐浓度变化对发菜细胞光合速率和呼吸速率的影响不显著。     

葡萄糖浓度波动对原代培养的大鼠血管细胞和肾细胞的影响

探讨葡萄糖浓度波动对体外培养的原代大鼠血管细胞和肾细胞的影响。取SD大鼠的主动脉和肾脏进行血管细胞和肾细胞的体外原代培养,每种细胞均分为6组:正常对照组、持续高糖组、持续低糖组、波动组I、波动组II、波动组III。实验24h后,测定细胞乳酸脱氢酶(LDH)的泄漏率,细胞液中的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAG)的活力,细胞内还原型谷胱甘肽(GSH)和超氧化物歧化酶(SOD)的活力。结果表明葡萄糖浓度波动各组均能对大鼠血管细胞和肾细胞造成损伤,使细胞外液LDH、NAG的泄漏量明显增加,细胞内GSH、SOD活力明显减少,与持续高糖组和持续低糖组比较差异显著(P<0.001)。且葡萄糖浓度波动对肾细胞的损伤比血管细胞更为明显。说明葡萄糖浓度波动能够导致大鼠血管细胞和肾细胞的损伤,并且其损伤远远大于持续高糖或持续低糖的单独作用效果,损伤的结果与低糖作用细胞的时间呈正相关,在相同的损伤条件下肾细胞比血管细胞对葡萄糖浓度波动更为敏感,损伤更为严重。     

水生无脊椎动物细胞培养

目前水生无脊椎动物的细胞培养研究远远落后于哺乳动物和昆虫的培养研究,其培养方法基本仍是套用哺乳动物或昆虫的细胞培养模式。尽管在几十年中进行了一些探索,而且原代培养也取得了一些进展,但到目前为止除了淡水蜗牛胚胎BGE细胞系外,其他动物都还没有成功的建立长时间持续传代的细胞系。现对水生无脊椎动物细胞培养的研究进行综述,并对所面临的主要困难进行了总结,对水生无脊椎动物细胞培养的前景提出了一些看法。     

GFP示踪观察移植瘤原代培养细胞的生长规律

采用GFP稳定表达的细胞系(293-BAC)接种裸鼠形成移植瘤.取肿瘤组织进行原代培养,通过GFP示踪和细胞形态学变化,观察了肿瘤组织中细胞的生长规律.肿瘤细胞释放并生长在组织块附近,向周围空间延伸.种植时散落的薄层组织细胞则直接贴壁生长.生长的鼠源间质细胞占总细胞量的1%～3%,散在或在组织新生肿瘤细胞外围集中生长.原代培养的细胞在传代5代以后,其中的鼠源细胞消失.经过成瘤和传代过程的肿瘤细胞生长性能稳定、来源纯净,是相关研究的好材料.观察到的细胞生长规律可为移植瘤的相关研究提供参考.     

大鼠髓核细胞原代培养及表型鉴定

目的:探讨Ⅱ型胶原酶联合透明质酸酶消化分离培养髓核细胞及免疫细胞化学表型鉴定的可行性。方法:无菌条件下分离SD大鼠凝胶状髓核,采用Ⅱ型胶原酶联合透明质酸酶消化分离髓核细胞并连续培养,倒置相差显微镜下观察,随后进行免疫细胞化学染色检测不同代次髓核细胞HIF-1、Ⅰ、Ⅱ型胶原、MMP2及蛋白聚糖的表达情况,并给予MTT法测定髓核细胞生长曲线。结果:Ⅱ型胶原酶联合透明质酸酶分离培养原代髓核细胞需要12 d左右贴壁,达95%融合需要34 d,而传代髓核细胞贴壁速率明显增快至10 h,且其倍增时间约为2.5 d;免疫细胞化学显示髓核细胞均表达HIF-1、Ⅰ、Ⅱ型胶原、MMP2和蛋白聚糖,且随着髓核细胞传代其HIF-1α、HIF-1β、Ⅰ型胶原及MMP2表达均增加,但Ⅱ型胶原表达降低,而蛋白聚糖表达无明显差异;MTT法显示随着髓核细胞传代其增殖有所减缓。结论:Ⅱ型胶原酶联合透明质酸酶可成功分离髓核细胞,提高培养效率,且HIF-1α、HIF-1β、Ⅰ、Ⅱ型胶原及MMP2可作为髓核细胞表型分子用于髓核细胞的鉴定。     

骨质疏松大鼠脂肪基质细胞成骨能力的研究

目的:探讨骨质疏松大鼠的脂肪基质细胞有无成骨能力。方法:采用去势法构建SD大鼠骨质疏松模型,设置2组样本,分别为19月龄骨质疏松SD雌性大鼠,正常19月龄SD雌性大鼠。每组大鼠分别取腹股沟脂肪垫中脂肪,用胶原酶消化法培养获得脂肪间充质干细胞,绘制并分析细胞生长曲线;再用经典的骨向诱导液诱导2组ASCs,比较2组细胞骨向分化能力有无差别。结果:骨质疏松大鼠与正常老龄大鼠的ASCs骨向分化能力无明显差别。结论:可用去势法构建SD大鼠骨质疏松模型,并可取其细胞行进一步研究。老龄骨质疏松大鼠的ASCs也可以考虑作为种子细胞促进其自体骨愈合,从而为利用自体ASCs促进骨质疏松骨愈合打下一定的理论基础。     

RA滑膜成纤维细胞的原代培养及鉴定

目的:改良体外分离、培养类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞的方法,并进行鉴定。方法:取关节镜手术中获得RA患者滑膜组织进行机械分离、胶原酶消化后直接将所有消化产物置于细胞培养皿两次贴壁培养,差速消化法纯化成纤维细胞,倒置显微镜观察细胞形态、流式细胞术及免疫细胞化学的方法鉴定细胞纯度。结果:胶原酶消化后直接贴壁结合差速消化纯化法分离获得的原代滑膜细胞中呈梭形的成纤维样细胞占98%以上,细胞核呈椭圆形位于细胞中央,偶见少量圆形的滑膜巨噬细胞。流式细胞术显示98%以上的滑膜细胞具有vimeintin+CD68的成纤维细胞特征。免疫细胞化学提示滑膜细胞vimentin表达阳性、CD68不表达。结论:成功分离获得了纯度和活性很高的人滑膜成纤维样细胞,方法更简便,效率更高,为后续类风湿性关节炎滑膜侵袭机制的研究奠定了基础。