C/EBP β对APP基因的表达调控作用的研究

该研究成功地构建了C/EBP β过表达慢病毒载体,在体外人胚肾细胞(HEK293FT)进行病毒包装并感染小鼠海马神经元细胞(HT22)。通过荧光素酶报告基因实验(luciferase assay)检测C/EBPβ对淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein,APP)启动子活性的影响;通过实时荧光定量PCR(Q-PCR)来检测C/EBPβ对APP和Sp1在转录水平上的表达;通过蛋白免疫印迹分析(Western blot assay)检测C/EBPβ对APP和Sp1蛋白表达的作用。萤火虫荧光素酶分析结果显示,C/EBPβ对APP启动子的表达有正调控作用;Western blot和Q-PCR分析的结果表明,C/EBPβ对APP和Sp1基因的表达有正调控作用。C/EBPβ对APP基因表达的调控作用的机制可能在于C/EBPβ上调了内源性转录因子Sp1的基因表达,而Sp1基因表达的增强直接导致了APP基因表达的上调。     

RA滑膜成纤维细胞的原代培养及鉴定

目的:改良体外分离、培养类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞的方法,并进行鉴定。方法:取关节镜手术中获得RA患者滑膜组织进行机械分离、胶原酶消化后直接将所有消化产物置于细胞培养皿两次贴壁培养,差速消化法纯化成纤维细胞,倒置显微镜观察细胞形态、流式细胞术及免疫细胞化学的方法鉴定细胞纯度。结果:胶原酶消化后直接贴壁结合差速消化纯化法分离获得的原代滑膜细胞中呈梭形的成纤维样细胞占98%以上,细胞核呈椭圆形位于细胞中央,偶见少量圆形的滑膜巨噬细胞。流式细胞术显示98%以上的滑膜细胞具有vimeintin+CD68的成纤维细胞特征。免疫细胞化学提示滑膜细胞vimentin表达阳性、CD68不表达。结论:成功分离获得了纯度和活性很高的人滑膜成纤维样细胞,方法更简便,效率更高,为后续类风湿性关节炎滑膜侵袭机制的研究奠定了基础。     

铜绿假单胞菌PAO1中c-di-GMP代谢相关基因PA0575对表型的影响

【背景】铜绿假单胞菌PAO1中存在与环鸟苷二磷酸(cyclic-di-guanosine monophosphate,c-di-GMP)代谢相关基因PA0575。【目的】探讨铜绿假单胞菌PAO1中环鸟苷二磷酸代谢相关基因PA0575对运动能力及生物膜的影响。【方法】通过PCR对菌株遗传背景进行确认;利用刚果红结合实验及电转PcdrA-gfp质粒间接测量胞内c-di-GMP水平;利用泳动性(swimming)、蜂群泳动(swarming)、蹭行运动(twiching)和生物膜定量实验对细菌进行表型分析,并在运动培养基中添加抗生素研究其对运动能力的影响;针对PA0575基因进行融合蛋白表达载体的构建,并对蛋白进行原核诱导表达。【结果】3株突变体菌株的转座子插入突变位点不一致,胞内c-di-GMP水平检测结果显示,PA0575-1菌株的c-di-GMP含量高于野生型PAO1菌株(P0.05),PA0575-2、PA0575-3菌株胞内c-di-GMP水平与野生型PAO1菌株无差异(P0.05)。运动能力检测实验中,与野生型PAO1菌株相比,PA0575-1菌株泳动性增强(P0.05);PA0575-2、PA0575-3菌株的泳动性、蜂群运动均增强(P0.05);该基因不同位点的突变均导致氯霉素对菌株的运动能力产生抑制作用。生物膜定量结果显示,与野生型PAO1菌株相比,细菌培养18 h后PA0575-1的生物膜含量降低(P0.05),PA0575-2、PA0575-3菌株的生物膜含量升高。最后成功构建了PA0575基因不同结构域的8个表达载体,并获得了异源表达蛋白。【结论】PA0575基因降低铜绿假单胞菌胞内c-di-GMP的水平,影响表型的同时也抑制了氯霉素抗性基因的表达。以上研究为PA0575基因对表型的影响奠定了基础。