佐剂诱导关节炎大鼠模型的建立及成纤维样滑膜细胞的分离

目的建立类风湿性关节炎（RA）动物模型;从炎性关节滑膜中分离成纤维样滑膜细胞（FLS）。方法应用热灭活结核杆菌H37Ra菌株与矿物油混合制备改良的佐剂,尾根部皮内注射Lewis大鼠诱导关节炎;剪取成功诱导关节炎大鼠的病变踝关节,从中剥离滑膜组织,充分剪碎后采用胶原酶消化法分离成纤维样滑膜细胞。结果成功诱导了大鼠关节炎,发病率为100%,发病时间有规律,组织学表现与RA相似;成功在体外培养了FLS并对其进行了鉴定,掌握了其生长形态和特征。结论成功制备RA动物模型并获得FLS,为今后RA发病机制探索和药物评价提供了良好的体内动物模型和体外细胞模型。     

原代成人皮肤真皮成纤维细胞系的构建

目的:对人皮肤成纤维细胞进行分离、纯化、培养及细胞鉴定,探讨优化的分离及纯化方法,为构建表皮-真皮皮肤模型提供种子细胞。方法:使用两步消化法提取人真皮层,酶消化法提取成纤维细胞后培养数代,对细胞进行形态学观察,HE染色,免疫细胞化学鉴定细胞标志物Vimentin,MTT法测定细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果:利用倒置显微镜及HE染色,可见细胞为散在分布的壁细胞,细胞汇流时呈鱼群样或漩涡状排列,细胞在30代内形态保持不变;细胞增殖曲线大体呈S型,流式细胞仪测得细胞凋亡率分别为(8.15±0.618)%和(7.83±0.415)%。结论:优化提取真皮成纤维细胞的方法,构建2株不同年龄的真皮成纤维细胞系,为药妆研究以及重组皮肤模型的研究奠定了基础。     

牛视网膜微血管内皮细胞体外分离与培养的实验研究

目的:探讨牛视网膜微血管内皮细胞(bovine retinal capillary endothelial cells,BREcs)体外分离、培养方法,为研究视网膜血管性疾病提供一定的实验基础。方法:无菌条件下取出视网膜并剪碎,经筛网过滤、胶原酶消化获取视网膜微血管内皮细胞,接种于明胶包被的培养瓶中,原代培养时用不同的培养基筛选细胞,并在传代时利用差速黏附法以获得较纯BRECs,通过形态学观察和免疫组化方法鉴定BRECs。结果:用此法原代培养BRECs纯度达98%,混有的血细胞及神经组织细胞碎片在换液和传代过程中逐渐被去除,成纤维细胞和周细胞的污染可分别用不同的培养基和差速黏附法纯化去除。结论:该方法简单有效,获得的BRECs纯度高,生长状态良好,为研究眼部血管性疾病提供良好平台。     

小胶质细胞纯化分离培养方法的改良

目的改良现有的小胶质细胞纯化分离培养方法,建立稳定简便的培养模型。方法利用盐酸利多卡因注射液代替机械振摇纯化分离小胶质细胞;利用CD11b/c(OX42)免疫细胞化学的方法对分离的小胶质细胞纯度进行鉴定,同时观察小胶质细胞形态及活化指标NFкBp65的表达情况;利用流式细胞仪,结合细胞计数及MTT细胞活力测定检测纯化分离后小胶质的增殖情况。结果改良的方法可稳定的获得1.2×106个/培养瓶(75cm2,250ml)的小胶质细胞,纯度达到98%,存活率≥95%,形态上以阿米巴样为主,继续培养3-5d,约半数细胞可转变为静止状态。NFкBp65免疫细胞化学染色为胞浆表达。流式细胞仪检测结合细胞计数及MTT细胞活力检测结果显示,体外纯化培养的小胶质细胞多位于G0/G1期,培养过程中未出现明显的增殖。结论改良的方法易于操作,产量多,纯度高。为体外小胶质细胞进一步研究提供了基础。     

脐带间充质干细胞成脂分化的研究

目的:探讨脐带间充质干细胞向成脂细胞方向分化的潜能,为脂肪组织工程提供一种来源丰富的干细胞来源。方法:采用胰酶和胶原酶Ⅰ型联合消化法获得脐带间充质干细胞,通过免疫细胞化学法对其表面标志物进行鉴定,化学诱导方法诱导脐带间充质干细胞向成脂细胞方向分化,倒置显微镜观察其形态变化,油红O染色对诱导后的细胞进行染色。结果:胰酶和胶原酶Ⅰ联合消化法分离的细胞贴壁生长,呈现成纤维细胞形态,免疫细胞化学显示脐带间充质干细胞表达CD29、CD44和CD105,但不表达CD31、CD34和CD105,脐带间充质干细胞在成脂诱导培养基中细胞生长速度明显减慢,细胞形态转变为肥大、扁平、含有大量脂滴的脂肪细胞,油红O染色示胞浆充满了油滴空泡。结论:脐带间充质干细胞具有向成脂细胞方向分化的潜能,为脂肪组织工程提供了一种来源丰富、免疫力低和低分化的种子细胞。     

成年SD大鼠心肌原代成纤维细胞分离及培养的优化方案

目的:摸索及优选成年SD大鼠心肌原代成纤维细胞的体外分离、培养及鉴定的实验方法。方法:将成年SD大鼠心脏剪成小组织块,采用以下四种方案(A:0.08%胰酶+0.1%胶原酶II消化15 min,B:0.2%胶原酶II消化15 min,C:0.2%胶原酶II消化60min,D:0.2%胶原酶II消化90 min)提取成年大鼠心脏原代成纤维细胞,再通过差速贴壁分离方法培养原代成纤维细胞。采用倒置显微镜观察成纤维细胞的基本形态特征,并进行Vimentiin免疫荧光染色对培养的原代细胞进行荧光鉴定;采用台盼兰染色对培养的原代成纤维细胞存活率进行鉴定;采用细胞计数对培养的成纤维细胞生长趋势进行鉴定。结果:四种方法均能培养成纤维细胞,但单酶消化60 min可一次性提取较多细胞,并且细胞状态佳,3 d即可传代。72 h成纤维细胞Vimentin免疫荧光染色阳性率高达97%。台盼兰染色可见其细胞死亡率明显降低,并且细胞计数可见细胞生长状态极佳。结论:单酶消化60 min是提取成年SD大鼠心肌原代成纤维细胞的高效、快速、稳定的实验方法,为心脏疾病的基础及临床研究提供了较为理想的细胞学实验模型。     

改良的乳鼠原代心房肌细胞的培养及鉴定方法

目的:主要探讨原代心房肌细胞的培养及鉴定方法,为进一步研究心房颤动的重构机制及治疗方法奠定基础。方法:选取1-3 d的SD乳鼠40只,雌雄不限,分离心房、心室肌,胰酶联合EDTA充分消化心房肌细胞,利用心房肌与成纤维细胞的差速贴壁及细胞传代方法纯化心房肌细胞,免疫细胞化学染色鉴定心房肌细胞。结果:心房肌细胞培养至第3天,可见心房肌细胞覆盖率高达90%,并出现波动性,免疫细胞化学染色可见90%的心房肌细胞肌经α-肌动蛋白抗体染色阳性。结论:经酶化学消化法可成功培养出原代心房肌细胞,是一种较好的培养及鉴定乳鼠心房肌细胞的方法。     

小鼠脂肪来源干细胞体外培养、诱导分化及鉴定

目的:观察C57小鼠ASCs (Adipose-derived stem cells,ASCs)体外培养的生物学特性,探讨其成脂成骨诱导分化能力.方法:无菌条件下切取C57小鼠腹股沟处脂肪组织,0.25％Ⅰ型胶原酶消化,分离培养ASCs,37℃,5％CO2饱和湿度孵箱培养,细胞融合达80％时消化传代.观察其细胞形态;MTT比色法测细胞生长曲线;流式细胞仪检测细胞表面标志物;取第2代细胞行成骨及成脂诱导培养,3周后分别茜素红染色和油红O染色鉴定.结果:从C57小鼠脂肪组织中分离获取的ASCs呈长梭形,成纤维细胞样.细胞生长曲线呈“S”型,证明ASCs具有很强的增殖能力;流式细胞术分析结果:CD29、CD44、CD90阳性表达,CD31、CD34、CD45阴性表达;成骨诱导后茜素红染色阳性,成脂诱导后油红O染色阳性.结论:本试验分离培养的细胞为ASCs,具有确切分化能力.     

大鼠膝骨关节炎滑膜细胞原代培养

目的:建立原代培养膝骨关节炎大鼠滑膜细胞的方法。方法:取膝骨关节炎大鼠膝关节滑膜组织,用酶消化法消化、分离细胞,用DMEM培养液进行培养并传代,观察滑膜细胞生长状况、并用细胞形态学及细胞免疫化学鉴定。结果:用酶消化法培养膝骨关节炎滑膜细胞,方法简单、成功率高、细胞形态典型。结论:单一的胶原酶消化法是一种有效的滑膜细胞原代培养的方法,可以满足一般实验需求。     

猪骨髓间充质干细胞的分离培养与鉴定

目的:建立猪骨髓间充质干细胞(pMSCs)体外分离培养、纯化和鉴定的方法,为下一步实验研究奠定基础.方法:采用密度梯度离心法获得骨髓单核细胞,接种后形成单层贴壁的成纤维样细胞.免疫荧光及PCR检测细胞表面标志及多能性基因的表达,并鉴定分离细胞的多向诱导分化潜能.结果:体外培养的原代细胞10天达到融合,传代后仍具有成纤维样的形态;免疫荧光结果见波形蛋白(Vimention)和Oct4标记阳性,CD45阴性;PCR分子检测见多能性基因OCT-4,nanog的表达;细胞具有分化为成骨细胞和成脂细胞的能力.结论:采用密度梯度离心法获得的pMSCs体外增殖能力强,纯度高,具有间充质干细胞的特性,pMSCs分离培养体系的成功建立为下一步实验研究奠定基础.