人乳头瘤病毒E7蛋白对细胞周期G1/S检查点的影响

高危型人乳头瘤病毒(HPV)感染与宫颈癌的发生关系已经明确,HPV编码的早期蛋白E7是HPV致宫颈癌的主要相关蛋白之一。G_1/S检查点是细胞周期中不可逆的关键点,决定了细胞进入细胞周期与否,与肿瘤的发生发展关系密切。pRb蛋白是调控细胞周期G_1/S检查点中的限速底物,是起调控作用的主要因子之一。E7通过影响pRb蛋白、E2F家族、Cyclin/CDK2复合物、p27蛋白、Dyrk1B等细胞周期相关蛋白来影响G_1/S检查点的正常工作,形成失控的细胞增殖。高危型HPV E7蛋白对细胞周期检查点的影响,既是HPV致癌机制的重要组成部分,也可能成为攻克此类癌症的突破口。本文综述了高危型HPV E7蛋白对细胞周期G_1/S检查点的影响。     

寨卡病毒感染者血液、尿液和唾液中IgA抗体水平初步研究

为研究寨卡病毒(ZIKV)感染者血清、尿液和唾液样本中特异性IgA抗体水平,进一步了解ZIKV感染免疫机制,本研究重组表达制备寨卡病毒NS1蛋白,对其浓度、纯度进行鉴定,初步评估了NS1蛋白抗原性,并建立间接酶联免疫(Indirect-ELISA)方法,检测患者临床血清、尿液和唾液样本中的寨卡特异性IgA抗体。利用健康人群血清、尿液和唾液标本,评估检测方法的特异性,并确定以阴性对照的均值加3倍标准差作为判定检测结果的阈值,特异性为100%。对经病毒核酸检测所确诊病例的33份血清样本、4份尿液样本和3份唾液样本进行检测。选择3份具有较高IgA抗体水平的血清,通过2倍系列稀释的方法评价了血清样本中特异性IgA抗体的滴度,可有效检出经3 200倍以上稀释的血清样本中的IgA抗体。重复性检测实验显示板间变异系数为(3.0±0.8)%,板内变异系数为(2.7±1.0)%。寨卡患者血清、尿液和唾液样本中的特异性IgA抗体的检出率分别为75.8%(25/33)、100%(4/4)和33.3%(1/3),提示IgA抗体在3种体液标本中均具有显著的存在,具有充当体外诊断指标的意义。同时尿液、唾液标本中特异性IgA抗体的存在,提示潜在的粘膜免疫效应,有助于增强对病毒体内播散和体外传播的理解,也初步提示了寨卡病毒NS1蛋白可用于相关免疫学诊断试剂的研发。     

鼠诺如病毒感染RAW264.7细胞中干扰素和干扰素激活基因转录水平研究

诺如病毒(Norovirus,NoV)是全球急性胃肠炎散发病例和暴发疫情的主要致病原。鼠诺如病毒(Murine norovirus,MNV)是研究诺如病毒的理想研究模型。本研究通过实时定量荧光PCR检测急性感染毒株MNV-CW1和持续性感染毒株MNV-SH1603感染Balb/c小鼠后的排毒情况以及感染RAW264.7细胞后不同时间点病毒RNA扩增、干扰素(Interferon,IFN)和干扰素激活基因(Interferon-stimulated gene,ISG)转录水平,以探讨不同的MNV毒株感染诱导IFNs和ISGs基因表达的特征。研究显示MNV-CW1和MNV-SH1603病毒感染Balb/c小鼠后排毒时间不同。MNV-CW1和MNV-SH1603病毒感染RAW264.7细胞后,6h后出现明显扩增,48h达到病毒复制高峰,随后复制速度减慢。MNV-SH1603增殖比MNV-CW1快。两种病毒感染RAW264.7细胞后能上调IFN-β,IFN-λ2,ISG15和ISG54转录水平。MNV-CW1感染后,诱导IFN-β,IFN-λ2和ISG15基因表达上调,而ISG54在感染24h后转录水平下降。MNV-SH1603感染初期IFN-β,IFN-λ2,ISG15和ISG54基因转录水平持续增高,感染24h后IFN-β和ISG54的转录水平明显降低,IFN-λ2和ISG15转录水平峰值在感染后72h。研究揭示MNV病毒感染RAW264.7细胞后能上调IFN和ISG基因表达,但是MNV-CW1和MNV-SH1603诱导的基因表达特征有异同。     

探究黄热病毒NS1蛋白在感染早期的诊断价值

为了探讨黄热病毒(Yellow fever virus,YFV)非结构蛋白1(Nonstructural protein 1,NS1)在感染早期的诊断价值。颅内注射YFV-17D感染乳鼠,每日处死1窝,收集抗凝血。Vero细胞和C6/36细胞感染YFV-17D病毒后,每隔12h收集培养上清。分别采用荧光定量PCR和基于YFV NS1多克隆抗体的双抗体夹心酶联免疫(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)方法检测感染后乳鼠血液、C6/36和Vero细胞上清中YFV的扩增情况和NS1蛋白的分泌规律。乳鼠感染YFV-17D后第2d在血清中即可检测到YFV NS1,第3d血液中检测到YFV核酸。敏感细胞株在感染YFV-17D后第36h培养上清中可检测到YFV NS1,而48h后才能检测到YFV核酸。YFV NS1蛋白具有作为YFV感染早期的诊断靶标的潜在价值。     

我国首株猪盖他病毒的分离与鉴定

盖他病毒(Getah virus,GETV)是一种广泛分布于欧亚大陆及澳大利亚北部太平洋沿岸的人兽共患虫媒病毒,我国目前各地仅从蚊子中分离到该病毒。本研究在对一猪场疑似猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)流产胎儿进行多重RT-PCR检测时,由检测猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)的一对引物扩增出一非特异性条带,测序及在NCBI数据库中BLAST结果显示,该序列与GETV序列高度相似。经病毒分离、传代、蚀斑纯化,获得一株能够在Marc-145细胞上稳定生长的分离物。电镜观察显示,该病毒有囊膜及纤突,直径约70 nm,接近于球形,具有披膜病毒科甲病毒属成员的典型形态特征,将该分离物命名为HNJZ-S1株盖塔病毒(Getahvirus)。全基因序列分析结果显示,分离物HNJZ-S1基因组全长11 689 bp,与GenBank中现有14株GETV序列相似性为97.4%～99.3%,其与韩国猪源毒株AY702913(登录号AY702913)序列相似性最高(99.3%)。遗传进化分析显示,HNJZ-S1与日本蚊源毒株12IH26、马源毒株14-I-605-C1、14-I-605-C2及中国蚊源毒株HB0234亲缘关系最近,处于同一进化分支。其E2基因推导的氨基酸序列分析结果显示,HNJZ-S1与韩国猪源毒株AY702913和QIAG9302以及日本马源毒株14-I-605-C1、14-I-605-C2和中国蚊源毒株HB0234等处于同一进化分支。本研究首次从我国发病猪群中检测并分离到GETV,也是迄今为止中国唯一一株来自脊椎动物的盖他病毒,对猪源GETV的感染谱和致病性、感染和传播机制、环境微生物学及公共卫生等相关研究具有重要意义,并为之提供了宝贵的研究素材。     

Ⅰ型马立克病毒UL24蛋白的原核表达及其亚细胞定位的研究

为研究Ⅰ型马立克病毒(MDV)UL24蛋白的亚细胞定位,以MDV GX0101为模板,PCR扩增UL24基因全长,分别克隆到原核表达载体pGEX-6P-1、pET-32a(+)和真核表达载体pEGFP-C1中。将原核表达重组质粒转化到大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中表达,并进行纯化和鉴定。用纯化蛋白免疫Balb/c小鼠,制备并鉴定抗UL24蛋白的多克隆抗体。通过间接免疫荧光试验(IFA)检测感染GX0101的鸡胚成纤维细胞(CEF)中的UL24蛋白。同时,将真核表达重组质粒pEGFP-C1-UL24转染CEF细胞,通过激光共聚焦显微镜观察UL24蛋白在CEF中的亚细胞定位。结果显示Ⅰ型MDV的UL24基因在原核表达载体中能够正确表达,免疫小鼠后获得抗UL24蛋白的多克隆抗体。该抗体可特异性识别MDV UL24蛋白,且MDV UL24蛋白在CEF的细胞质和细胞核中定位,以上研究结果为进一步研究MDV UL24基因的功能奠定基础。     

表没食子儿茶素没食子酸酯抗流感作用的研究进展

茶叶的饮用历史已有千年,其保健功效得到广泛关注。表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)是茶叶提取物中含量最高、活性最强的单体,研究表明EGCG具有显著的抗流感病毒活性。因其来源丰富、价格低廉、且无耐药,是抗流感药物的有利候选。本文首次针对EGCG的抗流感机制进行综述,全面评价EGCG的抗流感价值,为后续进一步开发EGCG类抗流感药物提供参考。     

寨卡病毒抑制剂的研究进展

寨卡病毒属于黄病毒科黄病毒属,主要通过伊蚊属传播。越来越多研究表明寨卡病毒感染与胎儿的小头畸型症和成人的格林巴利综合征紧密相关,但目前尚无有效的疫苗或FDA已批准的药物。新近研究表明,小分子抑制剂可通过多种机制抑制寨卡病毒。虚拟筛选技术、老药新用等思路有望为抗寨卡病毒药物的研发带来新突破。本文就目前寨卡病毒抑制剂的研究进展进行综述,旨在为发现新型高效寨卡病毒抑制剂提供依据及思路。     

降低重组腺相关病毒载体免疫反应的策略

重组腺相关病毒(Recombinant adeno-associated virus,rAAV)载体在基因治疗研究中应用广泛,但可能引发机体产生免疫反应,限制了其在基因治疗领域的临床应用,如何降低rAAV载体的免疫反应已经成为基因治疗领域的研究重点之一。本文从对rAAV载体的选择和对患者免疫抑制调控两个方面介绍降低rAAV载体免疫反应的策略。     

大鲵蛙病毒编码96L蛋白(ADRV-96L)的腺苷三磷酸酶活性和促进细胞生长作用

【背景】腺苷三磷酸酶(ATPase,ATP酶)是控制DNA复制起始及宿主对病原微生物的应答开关。近期关于水生动物虹彩病毒基因组学的研究表明,它们共享编码ATPase的基因。【目的】大鲵蛙病毒(Andrias davidianus ranavirus,ADRV)属于虹彩病毒科,是世界现存最大两栖动物——中国大鲵的致死性病毒病原体。为了鉴定病毒基因及其表达产物对病毒复制和宿主细胞的影响,对ADRV编码ATPase的基因ADRV-96L进行了克隆、表达及功能分析,阐明这个虹彩病毒核心基因的功能。【方法】采用Predic Protein软件分析序列,构建重组原核表达质粒p ET32a/His ADRV-96L,经IPTG(Isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside)诱导在大肠杆菌DE3中表达蛋白,用镍树脂纯化和咪唑液洗脱。钼蓝分光光度法检测产生的无机磷(Pi)以确定纯化ADRV-96L的ATPase活性。建立表达蛋白的稳定转染细胞系并进行鉴定,再分别通过绘制病毒的一步生长曲线和评估转染细胞的生长速率来测定该蛋白对病毒复制及细胞生长的影响。【结果】多重序列比对显示ADRV-96L存在含Walker A和Walker B基序的AAA-ATPase(ATPases associated with a variety of cellular activities,与各种细胞活性相关的ATPase)结构域(20-159位氨基酸)及两个高度保守的精氨酸。重组原核质粒表达了含ADRV-96L的52 k D融合蛋白,该蛋白质具有ATPase活性(酶的比活性平均为4.68 U/mg)。结果未检出ADRV-96L对病毒的复制影响,但显示该蛋白可促细胞生长。【结论】大鲵蛙病毒96L基因(ADRV-96L)编码一个促细胞增殖和生长的ATPase。