间充质干细胞双标记光学成像的体内试验研究

目的:验证双标记生物发光成像活体观测MSCs在肝癌裸鼠模型向肿瘤病灶的趋化作用的可行性。方法:应用fluorescence(荧光)与bioluminescence(生物发光)两种成像方法,对MSCs进行CM-Di I荧光标记及对人肝癌细胞Hep G2进行Fluc-慢病毒感染并由此建立裸鼠肝癌模型,构建双标记成像系统,应用精诺真小动物光学成像仪在裸鼠肝癌模型中观测间充质干细胞向肿瘤的趋化作用。结果:在鼠尾静脉注射标记MSCs细胞后21天荧光成像可见MSCs主要积聚于肿瘤病灶处及肝脏。生物发光成像后可监测到病灶处由luciferase标记肿瘤细胞(Hep G2)发出荧光;将荧光成像与生物发光成像所得图像经后处理融合后,可见证间充质干细胞像肿瘤病灶定向迁徙的生物过程。经肿瘤病理切片证实间充质干细胞成功迁徙至肿瘤病灶中。结论:应用间充质干细胞双标记光学成像系统实现MSCs在活体内对肿瘤的趋化过程进行观测是可行的。这种成像方法可作为下一步以MSCs为载体的肿瘤基因治疗的有效监测手段。     

SCoT分子标记在割手密遗传图谱构建中的应用

本研究以割手密GXS85-30×GXS87-16的杂交后代为材料,应用目标起始密码子多态性(SCoT)分子标记对杂交后代进行杂种鉴定,获得由157个单株组成的F1杂种群,同时对比SCoT、AFLP和SSR分子标记在割手密基因组多态性分析和获得分离标记的效果,证实SCoT在扩增DNA多态性上优于SSR分子标记,在获取分离标记上优于AFLP分子标记,验证了SCoT分子标记技术在割手密遗传分析中的应用效果,为割手密遗传分析和遗传图谱构建提供了一种新型高效的目的基因分子标记技术。     

^131I标记Tyr-GX1在荷瘤裸鼠体内分布和显像研究

目的：设计、合成酪氨酸（Tyr）修饰的肿瘤血管靶向肽GX1,研究^131I标记短肽Tyr-GX1在荷人胃癌裸鼠体内的生物学分布与显像,探讨^131I-Tyr-GX1短肽作为肿瘤血管靶向诊治药物的可能性。方法：利用Iodogen碘标法对Tyr-GX1进行131I标记,检测其标记率和体内外稳定性;建立荷人胃癌裸鼠动物模型,尾静脉注射标记肽,分别进行体内生物学分布实验和肿瘤显像实验,结果用PASW Statistics18.0统计软件进行分析。结果：1）.纸层析法结果计算表明,^131I-Tyr-GX1肽的标记率和放化纯均达90%以上;24 h稳定性测试表明,^131I-Tyr-GX1在室温下存放以及与人血清、鼠血清、PBS等溶液混合,其标记率仍然都维持在90%左右,说明其具有良好的体内外稳定性;2）.荷瘤裸鼠体内生物学分布研究显示：标记肽在荷瘤裸鼠双肾放射性计数测量最高;其次是肝脏、肿瘤等组织;脑、骨、肌肉组织放射性计数含量较低,给药24 h时,肿瘤/肌肉（T/M）、肿瘤/血液（T/Bl）、肿瘤/脑组织（T/Br）的放射性比值分别是5.78、4.06和23.01;3）.体内SPECT显像结果显示：尾静脉注射^131I-Tyr-GX1肽后4 h肿瘤部位已开始显影,并随时间的延长,显像逐渐清楚,至18 h时,肿瘤显像最清晰。结论：应用Iodogen碘标法成功标记Tyr-GX1短肽;尾静脉注射^131I-Tyr-GX1后,肿瘤部位可以出现放射性浓聚,表明^131I-Tyr-GX1短肽可以靶向结合于肿瘤部位,有望成为新一种胃肠道肿瘤诊断与治疗的药物。     

博落回SSR引物的开发以及遗传多样性分析

根据前期由本实验室完成的博落回转录组数据设计出65对引物,以浏阳产地的博落回为材料进行筛选,得到了28对有效引物.用这些引物对来自全国4个不同主要产区的博落回进行扩增,共扩增出引物159条带,其中多态性条带121条,占76.10%,共找到特征性条带13条.统计并比较4个不同产地的数据,经研究发现不同地区的博落回的遗传多样性较低,4个不同产地的博落回相似性较高.     

SSR分子标记在梨种质资源研究中的应用

SSR（simple sequence repeat）标记,又称微卫星标记,具有多态性高、重复性好、共显性、检测简单等优点,在果树树种的多样性、品种和亲缘关系鉴定等方面得到了广泛应用。就近年来SSR分子标记在梨种质资源研究上的应用,综述了SSR分子标记的筛选与开发研究、种质资源的分类与多样性研究、品种鉴别与亲子鉴定研究以及重要性状的SSR标记与定位研究进展,并对存在问题进行分析和展望,旨在为相关研究工作提供参考。     

两种方式对红螯螯虾同步产卵影响的研究

对红螯螯虾采取雌雄分养和烫伤雌虾单侧眼柄两种方法进行处理,研究其对红螯螯虾卵巢发育和产卵率的影响,进而判断对同步产卵的影响。结果显示,雌雄分开放养对雌虾性腺发育有促进作用,其性腺指数显著高于幼虾刚离体的雌虾和试验结束时未产卵的雌虾,而肝胰腺指数低于试验初的雌虾,但14 d的单放时间偏长;单养14 d组和烫伤单侧眼柄组的产卵率分别为35%和50%,小于对照组(75%);雌虾交配前不需要蜕壳;幼虾离体的雌虾不再次交配也可以产卵,但不一定能孵出苗。研究表明,雌雄分养和烫伤雌虾单侧眼柄对于刚理出的产空雌虾的同步产卵促进作用不明显,生产上对于幼虾离体后的雌虾应立即雌雄配组。     

敲除ebony基因导致二化螟体表黑色素沉积(英文)

【目的】二化螟Chilo suppressalis是中国和其他亚洲地区为害水稻的重要害虫。由于缺乏遗传学操作工具,对二化螟的功能基因组学研究受到严重限制。本研究的目的是借助一个标记基因ebony,在二化螟体内建立CRISPR/Cas9介导的基因编辑体系。【方法】以家蚕Bombyx mori ebony蛋白作为参考序列,通过TBLASTN程序在二化螟基因组数据库获得二化螟ebony基因的cDNA序列;通过PCR技术克隆二化螟ebony全长序列并进行生物信息学分析;运用qRT-PCR技术分析二化螟ebony基因在不同发育阶段(卵、幼虫、预蛹、蛹和雌雄成虫)和4龄幼虫不同组织(头、表皮、脂肪体、肠道和马氏管)中的表达模式;借助基于CRISPR/Cas9的基因编辑技术,把sgRNA/Cas9蛋白复合物显微注射到二化螟新鲜的卵内(产卵后2 h内),靶向敲除二化螟ebony基因。【结果】克隆得到二化螟Csebony基因(GenBank登录号: MZ846208)的全长cDNA序列,开放阅读框长为2 586 bp,共编码861个氨基酸。Csebony蛋白质的分子质量为9.5 kD,理论等电点为5.10,且在N端没有信号肽。结构域分析显示,Csebony有3个保守的结构域。系统发育树显示,Csebony与玉米螟Ostrinia furnacalis的ebony亲缘关系最近。qPT-PCR结果显示Csebony基因在蛹期和头部高表达。敲除Csebony导致二化螟幼虫、蛹以及成虫黑色素沉积。【结论】本研究结果表明,Csebony参与了二化螟表皮颜色模式的调控;CRISPR/Cas9基因组编辑技术可在二化螟中有效应用。借助标记基因在非模式生物中快速建立CRISRP/Cas9基因编辑体系,可为二化螟的功能基因组学研究提供有价值的遗传学工具。     

荧光标记珊瑚组织来源细菌及其与虫黄藻相互作用的显微观察

【背景】研究珊瑚-细菌、虫黄藻-细菌的相互作用是解析珊瑚健康机理的关键。对珊瑚共附生细菌进行稳定荧光标记有助于原位观察细菌与虫黄藻或珊瑚的相互作用。当前,对于野生型珊瑚共附生细菌遗传操作体系的研究有限,限制了对细菌与珊瑚、虫黄藻原位互作模式的揭示。【目的】建立一种适合专性海洋细菌的遗传操作体系,利用其对珊瑚组织来源细菌进行绿色荧光蛋白标记,用于研究标记菌株与虫黄藻的相互作用。【方法】通过电穿孔的方式将构建好的广宿主重组质粒转入供体菌(Escherichia coli WM3064),然后将供体菌与添加海水才可以生长的受体菌SCSIO 12696(港口球菌科,Porticoccaceae;分离自鹿角杯形珊瑚组织)按供、受体菌细胞数比分别为4:1、2:1、1:1比例混合,在25℃和30℃下于改良LB培养基上接合转移。显微观察标记细菌与虫黄藻相互作用。【结果】改良的LB培养基适用于需海水才可生长的专性海洋细菌的接合转移实验。接合转移的效率与供、受体菌的比例及温度有关。确定优化的接合转移条件为:供、受体菌的比例为1:1,温度为30℃。利用建立的接合转移体系,构建了增强型绿色荧光蛋白标记菌株SCSIO 12696。在激光扫描共聚焦显微镜下能清晰观察到标记菌株SCSIO 12696和虫黄藻在共培养时的相互作用。【结论】建立了适合专性海洋细菌的遗传操作体系,利用其构建荧光蛋白标记菌株可用于虫黄藻-细菌、珊瑚-细菌相互作用的研究,有助于揭示珊瑚共附生细菌的生态作用机制。     

基于大环分子葫芦脲的鸟氨酸脱羧酶实时无标记活性分析方法的改进与应用

鸟氨酸脱羧酶 (Ornithine decarboxylase,ODC) 是多胺生物合成途径中的关键酶,其主要功能是催化鸟氨酸脱羧生成腐胺。在多种疾病和肿瘤细胞中,ODC的表达水平和催化活性都高于正常细胞,因此抑制ODC的活性是相关疾病预防和治疗的一个潜在途径。ODC抑制剂的发现和检验依赖于对其催化反应进程的监测,常采用的途径包括利用高效液相色谱法检测腐胺产量和利用同位素标记法检测二氧化碳的产量等。这些检测方法的繁琐操作和成本极大地限制了其应用,尤为突出的问题是这些方法很难实现高通量检测和实时检测。文中研究了基于大环分子葫芦[6]脲 (Cucurbit[6]uril,CB6) 与荧光染料DSMI (Trans-4-[4-(dimethylamino)styryl]-1-methylpyridinium iodide) 的ODC酶活实时无标记检测法,系统分析了其应用范围和局限性,并对其进行了优化。最后,利用优化后的方法实现了对不同机制ODC抑制剂的活性评价。     

灰葡萄孢菌过氧化物酶体及细胞核的荧光蛋白标记

【目的】对灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)的细胞核和过氧化物酶体进行荧光蛋白标记,为研究其生长发育和侵染过程中细胞结构和细胞器动态提供基础。【方法】以绿色荧光蛋白(GFP)和红色荧光蛋白(DsRED、mCherry)为报告基因,利用根癌农杆菌介导转化(Agrobacterium tumefaciens mediated transformation,AtMT)将3种荧光蛋白标记载体分别导入灰葡萄孢菌标准菌株B05.10;通过PCR检测及荧光观察筛选和验证转化子,并进行单孢纯化;利用共聚焦显微镜记录细胞器荧光定位情况。【结果】获得了过氧化物酶体或细胞核稳定表达红、绿色荧光的重组单孢菌株,PCR验证表明标记基因成功整合入转化子基因组。在标记细胞核的菌株中,菌丝和孢子中可见多个明亮、圆形的荧光点,与DAPI染色共定位。标记过氧化物酶体的菌株中,菌丝和孢子中可见小点状绿色或红色荧光,在脂类物质诱导下荧光点数量明显增加,符合过氧化物酶体分布及动态特征。细胞壁染色结果显示,细胞壁染色产生的蓝色荧光与红、绿荧光蛋白的荧光互不干扰,标记效果良好。【结论】获得了理想的过氧化物酶体或细胞核荧光标记的灰葡萄孢菌菌株,为研究其细胞器动态以及生长发育与致病分子机制提供了参考和材料。