EDN3在不同毛色小鼠皮肤中的表达与定位

内皮素3（endothelin 3, EDN3）对早期黑色素细胞的迁移及增殖分化有促进作用,并可通过与其受体结合促进黑色素的合成。EDN3在不同毛色小鼠皮肤中的差异及其在毛色形成过程中的作用仍有待研究。实时荧光定量PCR结果显示,灰色小鼠皮肤中EDN3的表达量显著高于黑色及棕色小鼠,约为其2倍(P<0.01)。蛋白免疫印迹结果显示,灰色小鼠皮肤内EDN3的含量为黑色小鼠的5倍,棕色小鼠为黑色小鼠的2倍。ELISA结果表明,灰色小鼠皮肤中EDN3的蛋白质表达量分别是黑色和棕色小鼠的1.8倍和1.4倍(P<0.01)。免疫组织化学显示,EDN3在毛囊的毛基质及内外毛根鞘有明显表达,毛乳头等部位有少量表达。EDN3在不同毛色小鼠皮肤中的表达存在显著差异,是维持黑色素细胞存在不可缺少的因子,可能对两种色素颗粒的相互转化有一定的作用。     

贵州矮马IGF-I启动子-529 CpG甲基化及个别核苷酸变异与贵州矮马矮小表型有关

胰岛素样生长因子（insulin-like growth factors,IGFs）和生长（激）素（growth hormone,GH）是动物机体主要的促生长因子,它们的表达水平直接决定成熟个体的高度。贵州矮马的体高明显低于伊犁马等大型马,但其原因尚不清楚。本研究从贵州矮马基因组DNA中克隆了GH和IGF-I基因5′-侧翼序列,分别为239 bp和817 bp,包括部分启动子结构;进而采用生物信息学、比较基因组学方法对比分析了贵州矮马与伊犁马两个基因5′-侧翼序列/启动子的转录因子结合位点及潜在甲基化位点（CpG岛）分布。亚硫酸氢盐PCR测序法（bisulfite sequencing PCR,BSP）显示,两个马群的GH基因5′-侧翼区域（239 bp）内的6个CpG位点均发生了甲基化,甲基化频率无明显差异。然而,在IGF-I基因5′-侧翼区的148 bp片段内含有4个CpG位点中,贵州矮马的-529 bp处CpG位点的甲基化程度明显高于伊犁马（P < 0.01）,且该甲基化位点处于基本启动子邻近3′端;此外,两个马群IGF-I基因5′-侧翼区的-561 bp处检测到T、C碱基改变,导致贵州矮马的顺式调控元件/转录因子结合位点较伊犁马少1个,有可能影响IGF-I基因的转录效率。血清IGF-I浓度测定揭示,贵州矮马血清IGF-I含量极显著低于伊犁马（P< 0.01）。Spearman相关性结果显示,贵州矮马及伊犁马的IGF-Ⅰ基因甲基化频率与血清IGF-I浓度呈中度负相关（r=-0.468）,提示IGF-Ⅰ基因甲基化抑制其编码蛋白质的表达。结果证明,IGF-I启动子高甲基化及某些核苷酸（碱基）序列变异可能是贵州矮马个体矮小的部分原因。     

瞬时感受器电位M2通道抗原位点的兔单抗特异性检测

目的：筛选特异性较高的抗体以推动对瞬时感受器电位M2（TRPM2）通道结构和功能的研究。方法：以野生型昆明种小鼠大脑皮层、人胚肾293细胞、未诱导的TRPM2细胞及四环素诱导的TRPM2细胞为标本,采用免疫印迹和免疫荧光方法,以被检测抗体为一抗,荧光分子结合的抗体为二抗,根据170kD（TRPM2通道蛋白分子量）位置上是否有特异性条带,检测兔单抗的特异性。结果：抗体98927对鼠源TRPM2通道有特异性,抗体40622,抗体98721,抗体98921对人源TRPM2通道有特异性,另外抗体98721对鼠源TRPM2通道的突变型有特异性。结论：作为分子探针,抗体98927、40622、98721、98921可用于TRPM2通道结构和功能研究。     

决明胰蛋白酶抑制剂1活性相关残基的定点突变与抑制活性分析

决明胰蛋白酶抑制剂1（CoTI1）属于Kunitz胰蛋白酶抑制剂家族成员,通过序列比对预测Arg86、Leu84和Thr88等3个氨基酸残基可能是CoTI1发挥抑制作用的关键残基。通过定点突变的方法将Arg86、Leu84与Thr88残基分别突变为Asp残基,并考察各突变体对胰蛋白酶及棉铃虫等鳞翅目害虫消化酶的抑制作用。与CoTI1相比,CoTI1^R86D、CoTI1^T88D与CoTI1^L84D突变体对胰蛋白酶的抑制活性分别下降了93%、64%与59%;对棉铃虫、甜菜夜蛾、斜纹夜蛾等3种鳞翅目害虫消化酶的平均抑制活性分别下降了88.7%、57%与60.7%。以上结果表明Arg86、Leu84与Thr88是CoTI1发挥抑制作用的关键残基,这为CoTI1的抑制分子机制及抗虫研究提供了重要的理论依据。     

PI3K和受体型酪氨酸激酶介导家蚕麻痹肽免疫诱导信号的传递

【目的】普遍存在于鳞翅目昆虫中的ENF肽具有非常相似的结构和生理功能, 对昆虫的发育、 免疫、 应激反应等方面都起着重要的调控作用。有研究报道, 作为ENF肽家族成员之一的家蚕Bombyx mori麻痹肽（paralytic peptide, PP）通过激活MAPK来调控家蚕的免疫应答, 但其完整的分子作用机制尚不明确。本研究旨在解析传递家蚕PP免疫诱导信号的分子通路。【方法】首先通过荧光定量PCR检测了多种昆虫细胞系在PP诱导下抗菌肽基因的转录水平, 并利用Western blot检测p38 MAPK的磷酸化水平, 然后利用不同信号传递分子的抑制剂处理BmE细胞筛选参与传递PP免疫诱导信号的分子。【结果】PI3K抑制剂LY294002和受体型酪酸激酶抑制剂Genistein抑制了PP对BmE细胞抗菌肽基因表达的诱导作用; 且BmE细胞和家蚕血细胞在PP的诱导下, Akt和大小约为70 kDa的细胞膜蛋白均出现磷酸化水平的动态变化。【结论】PI3K/Akt信号通路和Genistein敏感性的受体型酪氨酸激酶介导了PP免疫诱导信号的传递。     

感染球孢白僵菌的家蚕免疫应答差异表达基因分析

【目的】筛选家蚕Bombyx mori应对白僵菌Beauveria bassiana侵染的应答基因, 以进一步研究家蚕抵御真菌侵染的分子机制。【方法】采用新一代Solexa高通量测序技术对感染白僵菌及未感染白僵菌的对照组家蚕进行了测序分析, 筛选差异表达基因; 结合生物信息学工具分析差异表达基因的功能注释、 分类及涉及的信号通路等; 应用荧光定量PCR技术验证10个基因的差异表达。【结果】通过测序和生物信息学分析共获得377个差异表达基因, 其中表达上调基因236个, 下调基因141个; KEGG通路分析表明, 各通路中既有表达上调的基因, 也有下调基因; 12个上调基因、 26个下调基因参与3个显著性富集的KEGG通路, 即核糖体、 氨酰tRNA生物合成和剪接体通路。定量PCR与测序结果显示, 溶菌酶、 热激蛋白、 谷胱甘肽S-转移酶、 肽聚糖识别蛋白等与免疫应激相关的蛋白基因均呈现表达上调。【结论】本研究筛选获得的差异表达基因, 特别是上调表达的基因可能与家蚕应对白僵菌侵染的应答机制有关, 其中与免疫应激相关的蛋白基因如溶菌酶、 热激蛋白、 谷胱甘肽S 转移酶、 肽聚糖识别蛋白基因等可能直接参与了家蚕对白僵菌的免疫识别和防御, 研究结果为从分子水平阐明家蚕抵御真菌侵染的防御机制和白僵菌对家蚕的致病机理提供新的依据。     

基于ChIP-Seq进行肿瘤睾丸抗原XAGE-1b基因表达蛋白的DNA结合位点鉴定

XAGE-1b（X antigen family member 1B）属于XAGE亚家族,是一种肿瘤 睾丸抗原（cancer/testis antigen,CTA）,表达于正常人睾丸组织和多种类型的肿瘤细胞中.本实验室前期研究发现,该基因在涎腺腺样囊性癌高转移细胞系中呈高表达.为了进一步研究XAGE-1b下游调控基因,本实验采用ChIP Seq技术筛查XAGE 1b蛋白质可能存在的DNA结合片段. 结果发现,XAGE-1b下游调控基因富集于细胞分裂（cell division,P-Value＝7.95e-04）、细胞周期调控（cell cycle,P-Value＝5.532e-03）、及癌症相关基因（GESA/MSigDB module_11,P-Value＝2.010e-06）中．同时发现,XAGE-1b下游调控多个基因的表达产物（NCBI/interactions 22827,P-Value＝4.678e-06）能与原癌基因c-Myc的启动子抑制蛋白PUF60发生蛋白质相互作用,并通过qPCR进行了验证．这些研究对阐明XAGE-1b在肿瘤细胞的增殖和转移中的作用有重要意义.     

SND1蛋白与HuR蛋白的相互结合作用

人源SND1（staphylococcal nuclease domain containing 1）蛋白由N端的SN（staphylococcal nucleases）结构域和C端的TSN (Tudor SN5) 结构域组成,其中SN结构域又包含SN1～SN4四个重复的功能片段. 本课题组前期研究结果表明,SND1蛋白可以通过SN结构域与G3BP（Ras GAP SH3 domain binding protein）蛋白相互结合,共同参与细胞应激颗粒（stress granules,SGs）的形成. SGs是真核细胞在受到氧化应激、病毒感染等外界刺激时在胞浆内形成的与RNA代谢相关的颗粒状结构. 对于SGs的成分鉴定及相互作用的分析一直是学者们研究的热点. 本研究中,免疫共沉淀实验结果表明,以抗SND1抗体可以共沉淀出HeLa细胞内另一个重要的应激相关人类抗原R（human antigen R,HuR）蛋白. 另外,利用脂质体转染法将pcDNA3 FLAG HuR重组质粒瞬时转染入HeLa细胞,成功过表达外源性的FLAG HuR融合蛋白,再以抗FLAG标签抗体又可以反向共沉淀出内源性SND1蛋白,证明SND1与HuR之间存在蛋白质间的相互结合作用. 细胞免疫荧光实验结果表明,当给予HeLa细胞05 mmol/L亚砷酸钠氧化应激时,SND1与HuR蛋白共同定位于胞浆中的SGs结构中. GST pulldown实验结果进一步表明截短的SN结构域可以结合HuR蛋白,其中以SN1功能片段的结合能力最强,表明SND1蛋白是通过SN结构域与HuR蛋白形成应激复合物,参与SGs的胞浆组装.并不定位于SGs的TSN结构域亦可结合HuR蛋白,提示SND1 HuR的蛋白相互作用可能并不局限于SGs,具有其它方面的功能意义.     

免疫磁珠纯化小鼠精原干细胞的研究

精原干细胞（spermatogonial stem cells,SSCs）富集纯化是利用SSCs进行基因修饰新方法等研究的前提基础。采用免疫磁珠分选法,使用干细胞抗体CD90.2进行小鼠SSCs的纯化富集,并采用流式细胞分析法和定量PCR验证了磁珠分选效率。流式细胞分析结果：免疫磁珠分选后SSCs纯度为50.11%。荧光定量PCR检测结果：磁珠分选后支持细胞特异表达基因 GATA4 显著下调（6倍）、SSCs表达基因 GFRα-1 上调（6.5倍）、生殖干细胞特异表达基因 OCT4 极显著上调（5.9倍）,3个基因相对表达量的变化说明,免疫磁珠分选效率为6倍。流式细胞分析法所产生的偏差可能是受到了未解离磁珠及SSCs本身转基因荧光的影响。     

盐度对暗纹东方鲀生长、非特异性免疫和抗氧化酶活力的影响

实验比较不同盐度处理对暗纹东方鲀（Takifugu obscurus）的生长、非特异性免疫和抗氧化酶活力的影响。实验设置6、12、18、24和30 5个盐度处理组,淡水组设为对照组。分别在实验的第1、第5、第10、第15、第20、第30、第40和第50天进行取样测定,并进行溶菌酶、碱性磷酸酶、超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活力测定。当盐度18时,鱼的生长受影响较小,而在盐度为24和30的高盐度组中鱼体生长受到较大抑制,并且死亡率随着盐度的增加而增高。经盐度处理后,溶菌酶和碱性磷酸酶活力先逐渐增加,在达到最高峰后又逐渐降低,在24和30的高盐度组中,最终酶活力显著低于对照组水平。超氧化物歧化酶和过氧化氢酶的活力也呈现出先增加后降低的趋势,最终保持与对照组相似的水平。结果表明,高盐度（24和30）对暗纹东方鲀的生长、非特异性免疫和抗氧化酶活力均有显著的影响。