双峰驼肾重吸收机能的细胞学证据

电镜下观察了18峰双峰驼（Camelus bactrianus)肾脏细胞的超微结构,探究驼肾重吸收机能的形态学证据。结果显示,驼肾近曲小管的刷状缘高而密集,上皮细胞胞质顶端具有丰富的管泡结构,侧基底指状突起和基底质膜内褶多而明显,板状嵴线粒体发达。远曲小管和远直小管游离面微绒毛短而稀少,胞质线粒体排列密集,质膜内褶更为发达。集合小管上皮包括多量的亮细胞和少量的暗细胞两种类型,亮细胞结构简单,线粒体稀少,暗细胞线粒体密集,由皮质至髓质,暗细胞数量呈递减趋势,但内髓仍见暗细胞分布。皮质间质极少,志细血管丰富,管壁内皮菲薄有孔。髓质直小血管亦为有孔内皮。上述结构特征表明,双峰驼具有很强的重吸收能力,与其节水耐干渴特性相适应。     

猪圆环病毒2型ORF2基因序列分析及真核表达载体的构建

根据ＧｅｎＢａｎｋ中猪圆环病毒２型（ＰＣＶ－２）ＯＲＦ２基因序列,设计一　对引物,应用ＰＣＲ从疑患断奶仔猪多系统消耗综合症（ＰＭＷＳ）的死亡仔猪组织病料中扩增出ＯＲＦ　２全基因（７０２ｂｐ）。将此片段克隆入ｐＧＥＭ－Ｔ　ｅａｓｙ载体,筛选获得重组质粒ｐＴＯＲＦ２,并对此质　粒中的插入序列进行了测序分析,结果表明本试验克隆的ＯＲＦ２与美国ＰＣＶ－２分离株ＡＦ２６４０３９　的核苷酸及氨基酸序列同源性均达到１００％,与其他ＰＣＶ－２毒株同源性分别为９２．３％～９８．　６％和　９２．３％～９６．６％。重组质粒ｐＴＯＲＦ２经　Ｂａｍ　Ｈ　Ｉ、Ｅｃｏ　Ｒ　Ｖ双酶切,回收ＯＲＦ２基因,转　移入真　核表达载体ｐＳｅｃＴａｇ２／ＨｙｇｒｏＢ的相应酶切位点之间,构建成重组质粒ｐＳｅｃＴａｇＯＲＦ２。此重组表　达载体的构建成功为进一步研究ＯＲＦ２编码蛋白的生物学活性及建立ＰＣＶ诊断试剂盒打下基础。     

鲍氏不动杆菌──鳜鱼暴发性死亡的新病原

1995年广东某地人工养殖的鳜鱼（Sinipercachuatsi）暴发传染病,大量病鱼急性死亡,引致严重经济损失。本试验从已接种嗜水气单胞菌（Aeromonashydrophila）和柱状噬纤维菌（Cytophagacolumnaris）疫苗的病鱼脏器中分离到一种细菌,经腹腔注射和鳃部接种人工感染健康鳜鱼及罗非鱼（Oreochomisspp．）,均复制出与自然发病相似的病例,主要特点为肝脏严重变性。从上述人工感染的病鱼体内再次分离到与自然发病相同的     

MGB(Minor Groove Binder)复合探针二重实时定量PCR检测大肠杆菌O157

以大肠杆菌O157rfbE和stx2为待检靶基因,设计两对引物和两条MGB探针,rfbE和stx2探针5′端分别用FAM和VIC基团标记,3′端均用Taqman-MGB标记。建立并优化了检测大肠杆菌O157的二重荧光定量PCR方法,可检测的最低DNA浓度是10拷贝/μL;实验中O157菌株检测结果均为rfbE阳性,而非O157菌株检测结果均为阴性;重复性实验中,批间差异小于80%,批内差异小于70%。实验结果显示此二重荧光定量PCR方法可对分离的可疑大肠杆菌O157菌株进行快速鉴定,同时得知菌株是否携带stx2毒力基因,有利于菌株毒力强弱的判定。     

传染性法氏囊病病毒多表位模拟肽串联基因的表达与免疫原性分析

用5株传染性法氏囊病病毒(IBDV)单克隆抗体(mAb)从噬菌体随机肽库中得到了5个含有不同IBDV抗原表位的模拟肽序列。在此基础上,将5个抗原表位用GGGS四肽连接构建多表位基因5epis。将该基因合成、克隆后,构建原核表达质粒pET-5epis,在大肠杆菌中表达重组多表位蛋白r5EPIS,经SDS-PAGE分析,r5EPIS占菌体总蛋白的15%、分子量10kDa。用IBDV单克隆抗体和多克隆抗体对r5EPIS进行免疫印迹对比分析,结果表明,r5EPIS具有IBDV特异性和免疫反应性。将r5EPIS经皮下注射免疫兔,400μg/只/次,免疫2次,间隔7d,用IBDV间接ELISA检测血清抗体,第一次免疫7d后抗体效价为1∶4000,第二次免疫14d后抗体效价升高到1∶256000,说明r5EPIS可诱导机体产生IBDV特异性抗体。用r5EPIS加免疫佐剂经肌肉注射免疫鸡,50μg/只/次,免疫2次后,血清抗体效价可达到1∶12800,用200个ELD50IBDV超强毒株GX8/99攻击实验鸡,r5EPIS免疫组全部存活,而单用佐剂对照组的死亡率为86.7%(13/15),证明r5EPIS可诱导机体产生抗IBDV感染的保护性免疫应答,预示构建的5epis可作为IBD多表位疫苗研究的候选基因。     

表达LacZ基因重组火鸡疱疹病毒（HVT）的构建

将不含任何启动子的Ｅ．ｃｏｌｉ ＬａｃＺ基因,插入火鸡疱疹平素ＦＣ－１２６株胸苷激酶编码区末尾的ＮｈｅⅠ位点,构建成转移载体质粒ｐＴＫＬａｃＺ。用此质粒和ＨＶＴ感染的细胞基因组总ＤＮＡ共感染鸡胚成纤维细胞,在Ｘ－ｇａｌ存在下,通过蓝斑筛选,分离到重组体ＨＶＴ。ｒＨＶＴ与野生型ＨＶＴ－ＦＣ－１２６株在ＣＥＦ中的生长特性完全相似,且在连续传代过程中能稳定表达ＬａｃＺ基因。     

表达新城疫病毒HN基因的重组火鸡疱疹病毒的构建

应用聚合酶链反应技术,用设计带有限制性酶切位点的引物,特异地扩增从起始密码子开始的１ ．８ ｋｂ 新城疫病毒（ Ｎ Ｄ Ｖ） 血凝素神经氨酸酶（ Ｈ Ｎ） 基因开放式阅读框,然后插入ｐ Ｔ Ｋ２ Ｂ 的 Ｎｈｅ Ⅰ位点,构建了含 Ｎ Ｄ Ｖ Ｈ Ｎ 基因的插入载体ｐ Ｔ Ｋ Ｈ Ｎ１ 和ｐ Ｔ Ｋ Ｈ Ｎ２ ,再与感染火鸡疱疹病毒（ Ｈ Ｖ Ｔ） 细胞的总 Ｄ Ｎ Ａ 共转染鸡胚成纤维细胞（ Ｃ Ｅ Ｆ） ,经有限稀释法和 Ｄｏｔｂｌｏｔ 筛选,得到含有 Ｈ Ｎ 基因的重组体ｒ Ｈ Ｖ Ｔ１ 和ｒ Ｈ Ｖ Ｔ２ 。经组织培养传代和 Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ 分析,表明重组体在感染细胞中表达了 Ｈ Ｎ 蛋白。重组体在 Ｃ Ｅ Ｆ 上的生长特性与亲本病毒相同,且在连续传代过程中保持稳定。为国内新城疫基因工程疫苗研制奠定了基础。     

FMDV vp1基因在烟草中表达及转基因烟草的免疫效果

通过三亲杂交法,构建克隆有阿克苏(Akesu/58)O型口蹄疫病毒vp1基因的双元表达载体pBin FMDV VP1.采用农杆菌介导法转化NC89烟草叶盘,经卡那霉素筛选,共获得49株抗性植株.对抗性植株总DNA进行目的基因的PCR检测,有40株阳性植株.对阳性植株总RNA进行目的基因的RT-PCR检测,有21株阳性植株.将7株ELISA和Western-blot检测阳性植株叶片提取物分别与弗氏佐剂乳化,在0、15、30和45d腹膜腔接种Balb/C小白鼠,于第4次免疫后第9d进行血清抗体检测;第12d用10 4SM\-\{50\}LD的同源强毒进行攻击;攻毒后24h采血,通过乳鼠病毒血症试验判定攻击Balb/C小白鼠的发病和保护情况.结果表明双元表达载体pBin FMDV VP1构建正确;vp1基因转入NC89烟草并获得表达;7组中有2组Balb/C小白鼠血清抗体呈阳性,攻毒保护率分别为100%和63%.证明2株转基因烟草表达的VP1蛋白具有较好的免疫原性,所免疫的2组Balb/C小白鼠对同源强毒攻击有一定的抵抗能力.     

拟南芥细胞壁关联蛋白激酶融合表达及多克隆抗体的制备

为了研究拟南芥中细胞壁关联蛋白激酶1(WAK1)基因功能,通过RT-PCR得到WAK1 cDNA片段,将其亚克隆至pET28a表达载体中进行表达,获得融合蛋白.用纯化的融合蛋白pET28aWAK1免疫家兔,得到抗WAK1抗体.Western blot结果显示该抗体能特异识别在原核表达系统内表达的抗原,抗WAK1的抗体对拟南芥中的WAK1蛋白具有高度的特异性.