肠出血性大肠杆菌(O157：H7)的特异性荧光探针检测方法的建立

目的:建立一种real-time PCR,快速准确检测肠出血性大肠杆菌O157:H7。方法:以肠出血性大肠杆菌0157:H7 rfbE为待检靶基因,设计一对引物和一条Taqman探针,探针5’端用FAM基团标记,3’端用TAMRA标记。通过重组质粒的构建,建立并优化了大肠杆菌0157:H7的荧光定量PCR检测方法。结果:在人工污染样本无需富集的情况下,检测的最低DNA浓度是10拷贝/反应(3CFU/mL);特异性检测实验中,0157菌株检测结果均为rfbE阳性,而非0157:H7菌株检测结果均为阴性;重复性实验中,批内、批间变异系数均小于3%。结论:实验结果显示此荧光定量PCR方法特异性、灵敏度高,重复性好,可对分离的可疑大肠杆菌0157:H7菌株进行快速鉴定。     

实时荧光定量PCR技术鉴别非O157∶H7大肠杆菌产志贺毒素菌株(STEC)的研究

本文运用实时荧光定量PCR的技术对菌株进行stx1基因、stx2基因、eaeA毒力基因检测;并对stx阳性、eaeA阳性的菌株进行O抗原基因rfbE(O157)、wzx(O26)、wbdI(O111)、ihp1(O145)、wzx(O103)检测。探究了实验室保存的94株非O157:H7大肠杆菌是否存在产志贺毒素菌株(STEC)存在;结果表明94株大肠杆菌中检出3株含有stx基因、12株含有eaeA基因;对stx和eaeA阳性菌株O抗原基因试验,检出2株含有wzx(O26)基;这2株大肠杆菌血清凝集试验结果为阳性。研究结果显示,实时荧光定量PCR技术具有特异性强,灵敏度高等特点,可用于产志贺毒素菌株(STEC)前期筛查。     

TaqMan探针荧光PCR检测肠出血性大肠埃希菌O157∶H7方法的建立

肠出血性大肠埃希菌(Enterohemorrhagie Escherichia coli,EHEC)O157∶H7是一种重要的传染病病原菌,以EHEC O157∶H7标准菌株rfbE保守区设计一对特异引物和一条探针,建立了检测EHEC O157∶H7核酸的荧光定量PCR检测方法.实验结果表明荧光定量PCR检测方法特异性好,最低检测限为20 cfu/mL,线性范围是102～108 cfu/mL.稳定性试验表明批内变异系数和批间变异系数分别为2.06％和2.45％.     

TaqMan探针荧光PCR检测肠出血性大肠埃希菌O157:H7方法的建立

肠出血性大肠埃希菌(Enterohemorrhagie Escherichia coli,EHEC)O157:H7是一种重要的传染病病原菌,以EHEC O157:H7标准菌株rfbE保守区设计一对特异引物和一条探针,建立了检测EHEC O157:H7核酸的荧光定量PCR检测方法。实验结果表明荧光定量PCR检测方法特异性好,最低检测限为20 cfu/mL,线性范围是102～108cfu/mL。稳定性试验表明批内变异系数和批间变异系数分别为2.06%和2.45%。     

大肠杆菌O157菌体抗原基因检测芯片的制备

选择编码O157菌体抗原特异合成酶的rfbE基因设计引物于口探针,并制备检测芯片,通过两次PCR扩增,制备荧光标记的靶序列,并与芯片进行杂交,检测O157菌株和非O157病原体。结果所有O157菌株均在芯片相应探针处出现阳性信号,非O157杂交结果均为阴性;芯片检测灵敏度比PCR检测高50倍。说明基因芯片可以快速、灵敏、特异地检测O157菌体抗原,为建立快速灵敏的检测细菌病原体特征和鉴别诊断的自动分析系统提供了新方法。     

双重荧光定量PCR检测志贺毒素stx1和stx2基因

目的建立一种双重荧光定量PCR检测志贺毒素stx1和stx2基因的方法。方法根据不同细菌来源的stx1和stx2序列,设计PCR引物和TaqMan探针,建立双重实时荧光定量PCR检测体系,进行灵敏度、特异性和重复性评价,并对腹泻患者粪便样本进行检测分析。结果双重实时荧光定量PCR检测含志贺毒素基因重组质粒的最低检测下限为102 copies/mL;该法对12种常见肠道病原菌均无特异性扩增,对不同浓度的标准质粒检测重复性高,Ct值变异系数均小于10%;对急性腹泻粪便标本的检测阳性率高于细菌分离培养。结论建立的双重实时荧光定量PCR可作为不同细菌来源的志贺毒素基因的快速鉴定方法,亦可用于人感染性腹泻标本的快速筛查。     

志贺毒素2型噬菌体ΦMin27的stx2基因突变株构建及其感染特性

[目的]通过构建一株stx2基因突变的志贺毒素2型噬菌体,来观察它对不同血清型大肠杆菌的感染特性.[方法]利用九噬菌体的Red重组系统,将氯霉素抗性基因(cat)插入到大肠杆菌O157:H7 Min27株的stx2基因中,获得O157:H7 Min27的突变菌株Min27(Astx::cat).用丝裂霉素对该突变菌株进行诱导,结合抗性标记和PCR方法筛选出一株突变的志贺毒素2型噬菌体,命名为ΦMin27(△stx::cat).采用双层琼脂平板法和氯霉素抗性筛选的方法,观察ΦMin27(△stx::cat)感染21株不同血清型大肠杆菌后的裂解和溶原转换情况.[结果]2株血清型分别为O 60和O 138的大肠杆菌可以被ΦMin27(△stx::cat)溶原感染,表现出对氯霉素的抗性,但没有形成噬菌斑,而大肠杆菌MG1655株既可以被溶原又可以被裂解.溶原的菌株经丝裂霉素诱导后,能释放出感染性的ΦMin27(△stx::cat)颗粒,并对大肠杆菌MC1061进行裂解形成噬菌斑.[结论]ΦMin27(△stx::cat)可以感染和溶原特定的大肠杆菌,且溶原菌株能释放出原感染性的噬菌体,显示出ΦMin27噬菌体具有携带外源基因在若干不同血清型的大肠杆菌间水平转移的能力,为进一步研究Stx噬菌体的感染机理和志贺毒素表达调控奠定了基础.     

志贺毒素2型噬菌体FMin27的stx2基因突变株构建及其感染特性

【目的】通过构建一株stx2基因突变的志贺毒素2型噬菌体,来观察它对不同血清型大肠杆菌的感染特性。【方法】利用l噬菌体的Red重组系统,将氯霉素抗性基因（cat）插入到大肠杆菌O157:H7 Min27株的stx2基因中,获得O157:H7 Min27的突变菌株Min27(Δstx∷cat)。用丝裂霉素对该突变菌株进行诱导,结合抗性标记和PCR方法筛选出一株突变的志贺毒素2型噬菌体, 命名为FMin27(Δstx∷cat)。采用双层琼脂平板法和氯霉素抗性筛选的方法,观察FMin27(Δstx∷cat) 感染21株不同血清型大肠杆菌后的裂解和溶原转换情况。【结果】2株血清型分别为Ｏ60和Ｏ138的大肠杆菌可以被FMin27(Δstx∷cat)溶原感染,表现出对氯霉素的抗性,但没有形成噬菌斑,而大肠杆菌MG1655株既可以被溶原又可以被裂解。溶原的菌株经丝裂霉素诱导后,能释放出感染性的FMin27(Δstx∷cat)颗粒,并对大肠杆菌MC1061进行裂解形成噬菌斑。【结论】FMin27(Δstx∷cat)可以感染和溶原特定的大肠杆菌,且溶原菌株能释放出原感染性的噬菌体,显示出FMin27噬菌体具有携带外源基因在若干不同血清型的大肠杆菌间水平转移的能力,为进一步研究Stx噬菌体的感染机理和志贺毒素表达调控奠定了基础。     

畜禽肉沙门氏菌和大肠杆菌O157多重PCR检测研究

沙门氏菌和大肠杆菌O157都是目前世界公认引起食源性疾病的重要致病菌.本研究针对致病茵传统检测方法耗时长、过程繁琐的缺点,建立了同时检测畜禽肉及其制品中沙门氏菌和大肠杆菌O157的多重PCR分子检测方法.结果表明:分别针对沙门氏茵侵袭基因invA、大肠杆菌O157抗原基因rfbE建立的多重PCR方法可简便、快速、灵敏地实现对沙门氏菌和大肠杆菌O157的同时检测,整个过程在9h～10h内完成,人工污染猪肉检测限分别达到2.4×102cfu/mL(沙门氏菌)和2.2×102 cfu/mL(大肠杆菌O157);为食源性致病菌的检测提供了理想手段,有良好的应用前景.     

肉类中大肠杆菌O157:H7多重PCR检测方法的建立

以编码大肠杆菌O157抗原的rfbE基因、 编码H7抗原的fliC基因以及编码毒力因子的eaeA基因为靶基因, 选择3对引物, 建立并优化了检测大肠杆菌O157:H7的多重PCR体系, 扩增产物分别为291 bp、625 bp、368 bp, 采用30株细菌验证了该多重PCR具有特异性。PCR检测的灵敏度在DNA水平上达到91.35 pg; 在存在干扰菌鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella?typhimurium)的情况下, 当起始污染量为1.4 CFU/mL时, 37 ℃培养6 h 即可检出。在30份肉类样品中, 有3份检出了大肠杆菌O157:H7。本研究建立的多重PCR方法可特异、灵敏地实现对大肠杆菌O157:H7的检测。     

Investigation of the mechanism of temperature sensitivity of the electroreceptors of ampullae of lorenzini

In experiments on Black Sea skates (Raja clavata), the potential of the receptor epithelium of the ampullae of Lorenzini and spike activity of single nerve fibers connected to them were investigated during electrical and temperature stimulation. Usually the potential within the canal was between 0 and –2 mV, and the input resistance of the ampulla 250–400 k. Heating of the region of the receptor epithelium was accompanied by a negative wave of potential, an increase in input resistance, and inhibition of spike activity. With worsening of the animal's condition the transepithelial potential became positive (up to +10 mV) but the input resistance of the ampulla during stimulation with a positive current was nonlinear in some cases: a regenerative spike of positive polarity appeared in the channel. During heating, the spike response was sometimes reversed in sign. It is suggested that fluctuations of the transepithelial potential and spike responses to temperature stimulation reflect changes in the potential difference on the basal membrane of the receptor cells, which is described by a relationship of the Nernst's or Goldman's equation type.I. P. Pavlov Institute of Physiology, Academy of Sciences of the USSR, Leningrad. I. M. Sechenov, Institute of Evolutionary Physiology and Biochemistry, Academy of Sciences of the USSR, Leningrad. Pacific Institute of Oceanology, Far Eastern Scientific Center, Academy of Sciences of the USSR, Vladivostok. Translated from Neirofiziologiya, Vol. 12, No. 1, pp. 67–74, January–February, 1980.     

Determination of stoichiometry of radioiodination of proteins

A sensitive method for the detection of small quantities of hydrophobic antioxidant free radical scavengers such as butylatedhydroxytoluene (BHT) and butylatedhydroxyanisole (BHA) in aqueous samples is described. The procedure involves extraction of the hydrophobic free radical scavenger into an organic solvent phase, followed by the subsequent reaction of an aliquot of this extract with the stable cation radical tris(p-bromophenyl)amminium hexachloroantimonate (TBACA). In experiments with BHT and BHA, the loss of TBACA absorbance at 730 nm was found to be linearly proportional to the amount of antioxidant added, with quantities of BHT as small as 200 pmol being easily detectable. In aqueous suspensions of dimyristoylphosphatidylcholine vesicles, assays of the aqueous BHT concentration showed that BHT partitioned strongly into the membrane phase, achieving very high BHT/phospholipid ratios. For a given concentration of BHT, partitioning into the membrane phase was greater in large, multilamellar liposomes than in either small, single-walled vesicles or in purified rat brain synaptic vesicle membranes. Direct assay of BHT and BHA in phospholipid membranes, however, was complicated by a nonspecific interaction between TBACA and the phospholipid.