HIV-1 tat基因改造及其蛋白表达、纯化与抗体制备

目的:为了方便实验室工作中HIV-1B'/C亚型及C亚型Tat蛋白的检测,制备了相应的Tat蛋白及其抗体。方法:将我国HIV-1B'/C亚型流行株tat基因的第1个外显子和HIV-1C亚型tat基因的第2个外显子融合在一起,将密码子替换为大肠杆菌的优势密码子,通过合成引物、PCR拼接的方法,获得目的基因序列;在原核系统中与pET32a 载体中的His·Tag、Trx·Tag及S·Tag进行融合表达;目的蛋白经Ni 金属螯合层析柱纯化后,用于免疫家兔,制备多克隆抗体。结果:PCR拼接获得306bp的目的基因序列;在原核系统中融合表达得到相对分子质量约31000的融合蛋白,占菌体总蛋白的21%。纯化后的融合蛋白免疫家兔,制备了多克隆抗体,Western印迹结果显示,获得的多克隆抗体与HIV-1B'/C亚型的Tat蛋白反应良好;间接免疫荧光结果表明,获得的多克隆抗体与HIV-1B'/C亚型和C亚型的Tat蛋白都能产生特异性反应。结论:制备的多克隆抗体能够使用间接免疫荧光方法检测HIV-1C亚型的Tat蛋白,使用Western印迹方法和间接免疫荧光方法都能检测HIV-1B'/C亚型的Tat蛋白。     

基于微卫星位点的人工圈养豚鹿亲子关系鉴定

豚鹿属我国国家I级重点保护动物,目前国内野生种群已经灭绝,人工圈养数量少,已极度濒危。成都动物园是国内最大的豚鹿饲养单位,对该园内豚鹿进行亲子鉴定及遗传谱系建立是我国豚鹿拯救工程中一重要环节。本文利用7个微卫星标记对成都动物园27只豚鹿个体进行了基因分型,在母本已知情况下成功鉴定了13对父子关系,其中排除法鉴定8对,似然法鉴定5对且置信度达95%。将亲子鉴定的结果辅以动物园豚鹿圈养的历史记录,我们构建了该园豚鹿的遗传谱系图。本文的研究成果将为后续人工繁殖中亲本雌雄配对的个体选择以及种群的遗传管理提供参考。     

基于16S rRNA基因和细菌基因组间重复序列的DNA指纹图谱技术对肝硬化大鼠肝移植后肠道菌群多样性的研究

目的应用PCR-DGGE和rep-PCR技术对肝硬化大鼠肝移植后肠道菌群多样性进行研究,探讨肠道菌群多样性的变化,并比较这两种方法在菌群分析中的作用。方法首先建立CCL4诱导肝硬化大鼠的肝移植模型,收取对照组、肝硬化成模时、肝移植后7 d和肝移植后30 d的大鼠粪便,提取细菌基因组DNA,采用PCR-DGGE和rep-PCR[BOX-PCR,ERIC-PCR,ERIC2-PCR,(GTG)5-PCR,REP-PCR]进行DNA指纹图谱分析。结果PCR-DGGE可明确将正常大鼠、肝硬化大鼠、肝移植大鼠分为3个簇,并显示出肝硬化、肝移植大鼠肠道菌群多样性明显增多。rep-PCR技术也可将各组分开,其中ERIC-PCR、ERIC2-PCR及REP-PCR三者扩增条带各组差异有显著性,鉴别效果更好。结论应用基于16S rRNA基因和细菌基因组间重复序列的指纹图谱技术对肝硬化大鼠肝移植后肠道微生态的研究具有重要价值,可对临床肝硬化、肝移植患者肠道微生态制剂的使用起到指导作用。     

18例肺曲霉病临床分析

目的提高对肺曲霉病的认识。方法对诊断为肺曲霉病的18例病例的临床资料进行回顾性分析。结果83%的肺曲霉病患者伴有基础疾病;有临床症状者占89%;胸部影像表现为：以右肺为主,多见于上叶,且多分布于外周;大叶性肺炎型占17%,肺曲霉球型占50%,结节或肿块型占33%,支气管肺炎型占6%,双肺弥漫病变型占22%,且有22%合并胸腔积液;组织病理学发现呈约45°分支和有隔膜的曲霉菌丝;50%患者行肺叶切除术,术后应用抗真菌药物,50%患者仅接受抗真菌药物治疗;89%的患者治愈或好转,11%死亡。结论肺曲霉病患者多有基础疾病;部分类型有典型影像学改变;诊断需结合既往病史、临床表现和胸部影像表现及相关实验室检查,确诊有赖于组织病理学检查;治疗主要是药物,部分可手术。     

干旱耐逆基因（HS1）转化甘薯获得转基因植株

以甘薯（1pomoeabatatas（L.）Lam．）品种栗子香的胚性悬浮细胞为受体材料,用根癌农杆菌介导法,获得了表达除草剂抗性基因bar基因的转HSl基因甘薯植株。共计380个遗传转化的胚性细胞团,在添加2mg／L2．4-D、100mg／L Carb和10mg／L Glu（glufosinate）的固体Ms培养基上选择培养9周后,得到了12个Glu抗性愈伤组织。将这些抗性愈伤组织转移到添加1mg／L ABA、100mg／L羧苄青霉素和10mg／L Glu的固体MS培养基上,其中的3个抗性愈伤组织再生出拟转基因植株。PCR鉴定它们为转基因植株。Southern blot分析表明,HS1基因已整合到基因组中。转基因植株具有稳定的除草剂抗性。结薯观察实验结果表明,转基因植株结薯正常。     

3种市售免疫调节剂作为流感病毒融合蛋白NM2e亚单位疫苗佐剂的研究

目的:观察具有免疫调节作用的市售左旋咪唑、西米替丁、伐地那非作为甲型流感病毒核蛋白(NP)与基质蛋白2胞外区多肽(M2e)融合蛋白NM2e亚单位疫苗佐剂的可能性。方法:将左旋咪唑、西米替丁、伐地那非单独或者分别与Al(OH)3配伍作为NM2e蛋白佐剂,经肌肉注射免疫BALB/c小鼠,通过体液和细胞免疫检测及病毒攻击实验研究这些免疫调节剂作为疫苗佐剂的可能性。结果:左旋咪唑对NM2e蛋白亚单位疫苗无明显的佐剂效应,但与铝佐剂合用可使攻毒后存活小鼠体重恢复加快;西米替丁可以明显提高NM2e蛋白诱发的特异性IgG2a滴度,提高攻毒后小鼠的存活率(30%),但保护效果明显低于铝佐剂(70%),与铝佐剂无明显的协同作用;伐地那非能明显增加NM2e蛋白诱发的特异性IgG1、IgG2a滴度,提高攻毒后小鼠的存活率(36%),但与铝佐剂合用有相互抑制作用。结论:左旋咪唑、西米替丁、伐地那非对NM2e蛋白均有一定的免疫调节作用,其中西米替丁和伐地那非能提高攻毒保护效果,但保护效果明显低于Al(OH)3,与Al(OH)3联合使用均无协同作用。     

甲型H1N1流感病毒血凝素蛋白单抗杂交瘤细胞株的制备与初步鉴定

目的:建立具有高特异、高效价的甲型H1N1流感病毒血凝素蛋白(HA)单抗的杂交瘤细胞株。方法:以纯化的昆虫杆状病毒表达的甲型H1N1流感病毒HA蛋白为免疫原免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与Sp2/0小鼠骨髓瘤细胞融合,通过有限稀释法筛选阳性克隆,经ELISA和Western blot分析单抗的特性和特异性。结果:获得6株甲型H1N1流感HA抗原特异单克隆抗体杂交瘤细胞株,抗原肽库ELISA检测结果表明其中3株(1E12,3F12,1C11)单抗只与甲型H1N1流感HA抗原肽库反应,不与H5N1病毒HA抗原肽库反应;Western blot分析表明,单抗1B3只特异识别甲型H1N1流感HA抗原,而与其他季节性甲流病毒(H1,H3)及人禽流感H5N1病毒不反应。结论:所获杂交瘤细胞株特异性强,效价高,分泌抗体性能稳定,为分析甲型H1N1流感病毒抗原性位点、建立诊断试剂奠定了基础。     

对枯萎病不同抗性的香蕉品种的内生细菌多样性及群落结构

【目的】了解抗感品种香蕉植株中内生细菌与香蕉枯萎病间的关系,从而为香蕉枯萎病的发生与防控提供一定的理论基础。【方法】通过基于16S rRNA的末端标记限制性片段长度多态性技术(Terminal restriction fragment length polymorphism,T-RFLP)分析健康和感枯萎病香蕉植株不同品种各组织,以及香蕉植株不同发病时间根组织中内生细菌的多样性和群落结构。【结果】抗病品种"农科一号"植株根、假茎、叶片各组织中内生细菌的种类基本都比感病品种"巴西蕉"的相应组织中的要丰富。感枯萎病香蕉植株根、假茎、叶片各组织中内生细菌种类基本都比健康植株各组织的丰富。在植株发病前、发病初期、再到发病后一个月的不同时期,对于抗病品种而言,其内生细菌的多样性都基本保持稳定,而感病品种则变化幅度较大。同时发现不同品种不同组织的内生细菌的优势种群有所不同,且不同品种健康和发病植株都存在一些特有优势种群。【结论】香蕉抗病品种比感病品种植株中内生细菌的多样性更丰富且更稳定;感枯萎病植株中的内生细菌种类比健康的丰富;而且不同抗性品种中健康和感病植株内的优势种群存在明显差异。     

马铃薯遗传转化体系的优化及玉米淀粉分支酶基因SBEⅡb的导入

以马铃薯脱毒试管苗茎段为转化受体材料,建立并优化了农杆菌介导的马铃薯遗传转化体系。通过农杆菌介导法将玉米淀粉分支酶基因(Starch branching enzyme b,SBEⅡb)的过表达载体转化马铃薯,接种762个茎段,共获得35株抗性植株。经PCR检测获得了4株转基因阳性植株;对转基因植株进一步进行GUS活性组织化学染色,发现转基因植株的茎段与试管薯均被染上蓝色,表明外源SBEⅡb基因已整合到马铃薯基因组,且正常表达。     

董棕和短穗鱼尾葵光合效率日变化及其与生理生态因子的关系

利用美国产CI-340便携式光合测定系统,对董棕和短穗鱼尾葵的光合日变化特性进行了测定,通过相关分析和通径分析探讨净光合速率与生理生态因子的关系,并利用二项式数学模型对其光合光响应曲线进行了拟合.结果表明:(1)2种棕榈植物的净光合速率日变化都呈现不对称的双峰曲线,有明显的"午休"现象,董棕的午休深度及时长明显大于短穗鱼尾葵,其第二峰出现的时间比短穗鱼尾葵延后2h,这可能主要由于两者在气孔导度及蒸腾速率等自身生理因子活性方面的差异所致.(2)影响董棕和短穗鱼尾葵净光合速率日变化的主要决定生理因子均为胞间CO2浓度,但主要限制因子董棕为气孔导度,短穗鱼尾葵为叶面温度;主要决定生态因子董棕为光合有效辐射,短穗鱼尾葵为空气CO2浓度,主要限定因子两者均为空气相对湿度.(3)董棕和短穗鱼尾葵均具有较高的光补偿点和光饱和点,属强耐阳性植物,但鱼尾葵相对较低,更适于北移引种栽培.