γ-辐射与常规方法灭活产单核细胞李斯特菌对小鼠免疫原性的比较

【目的】以产单核细胞李斯特菌(Listeria monocytogenes, LM)为模式菌, 比较γ-辐射及常规的热灭活、甲醛灭活制备的灭活李斯特菌对小鼠的免疫原性。【方法】以γ-辐射、热灭活和甲醛灭活法分别制备灭活的LM;腹腔注射BALB/c小鼠,ELISA检测各组灭活菌产生的抗体水平;观察野生型LM攻击后各组的保护效果,动态监测体内带菌情况;流式细胞仪分选免疫小鼠T细胞,以T细胞转移实验评价辐射灭活的LM产生的免疫应答。【结果】 辐射灭活组、热灭活组和甲醛灭活组产生的抗体水平分别为：1:1280, 1:640, 1:160;野生型细菌攻击后这3种灭活菌产生的保护率分别为：100%、35%、30%,其中免疫辐射灭活菌的小鼠能够较快清除攻击的细菌;辐射灭活李斯特菌能够激发产生T细胞保护性免疫应答。【结论】较之传统的灭活方法,利用γ-辐射制备的灭活LM免疫小鼠后能够产生较好的保护效果。     

江苏某地健康绵羊群产志贺毒素大肠杆菌体内分离株的分子流行病学及致病力

【目的】探讨江苏某羊场健康绵羊体内产志贺毒素大肠杆菌的带菌和流行情况,同时就分离株的致病力和对Vero细胞的毒性作用作了研究。【方法】基于本实验室已经建立的EHEC O157:H7 EDL933W株的stx1、stx2、eaeA、hlyA四个基因的多重PCR检测并配合选择性增菌、平板筛选等方法对STEC进行分离鉴定。【结果】在为期6个月的连续跟踪调查中,共分离到STEC菌株107株,分离率为19.4%(107/550)。分离株属于41种O血清型、62种O:H血清型,未定型(ONT)有22株,粗糙型(OR)1株。其中属于绵羊STEC的优势血清型有O5(2株)、O91(1株)、O103(1株)。本文检测到的优势血清型为O93,stx2阳性菌株的分离率较stx1阳性菌株的分离率高,LD50测定结果表明分离株对小鼠致病力不高,受试的3个分离株均不能致小鼠死亡。对107株stx阳性分离株噬菌斑试验表明,71株阳性菌株携带噬菌体(66.3%,71/109)。受试分离株进行Vero细胞毒性试验,其中有一个菌株stx基因阳性但不能使Vero细胞产生病变。【结论】绵羊是STEC的天然宿主,可健康带菌。虽然STEC分离株对小鼠的致病力较弱,但不能排除其对人类安全的威胁。STEC携带志贺毒素基因并不意味着一定表达志贺毒素,需对志贺毒素的表达及调控机理做进一步的研究。     

肠炎沙门氏菌鸡源株ompR 基因缺失株的构建及生物学特性与亲本株的比较

【目的】为了探讨ompR基因在肠炎沙门氏菌生物被膜形成及毒力中的作用。【方法】以肠炎沙门氏菌作为母本,运用自杀性载体pGMB151构建了ompR基因缺失株,结晶紫染色法和扫描电镜观察测定缺失株的生物被膜形成能力,细胞的吸附和侵入及小鼠攻毒试验测定缺失株的毒力。【结果】RT-PCR和蛋白表达证明了ompR基因缺失株构建成功;该缺失株不表达纤维素和菌毛,不形成生物被膜;上皮细胞吸附和侵入试验表明缺失株与野生株具有相同的吸附和侵入率;BALB/c鼠腹腔感染性试验表明,缺失株的半数致死量为106.67CFU,而野生株的半数致死量小于2 CFU。【结论】ompR基因既是肠炎沙门氏菌生物膜形成的调控基因,又是重要的毒力基因。     

微生物组与动物疫病防控

微生物组研究的发展推动了人类不断探索人体微生物群与疾病之间的相关性。然而,微生物组学在动物疫病防控中的研究尚处于起步阶段。本文对动物疫病防控领域中微生物组研究所发挥的6个作用进行了阐述：揭示疾病与菌群的相关性,鉴定新发病原体,确立有益于维持机体健康生长的菌群,筛选疾病防控的新药物和新制剂,开发新疫苗或改进疫苗的使用效果,提出更简单有效的防控措施。     

肠炎沙门菌肽脯氨酰顺反异构酶SlyD的基因敲除、表达及酶学特征

【目的】以肠炎沙门菌肽脯氨酰顺反异构酶SlyD为对象,构建基因缺失株及表达纯化该蛋白,为研究其在肠炎沙门菌致病性与应激等方面的作用奠定基础。【方法】参考Gen Bank登录的肠炎沙门菌基因组序列设计用于slyD基因敲除及原核表达的特异引物,运用自杀质粒介导的同源重组技术对肠炎沙门菌C50041 slyD基因进行敲除,构建C50041ΔslyD缺失株;原核表达SlyD蛋白,通过α-糜蛋白酶耦联法对其PPIase活性进行测定;利用生物信息学相关软件,分析SlyD蛋白的氨基酸序列及功能域。【结果】PCR鉴定与测序结果证明成功构建了肠炎沙门菌C50041ΔslyD缺失株,其生长特性与野生株基本一致;SDS-PAGE及PPIase活性分析表明,获得了具有生物活性的可溶性SlyD蛋白;生物信息学分析显示SlyD蛋白由FKBP样肽脯氨酰顺反异构酶结构域、分子伴侣功能域和金属结合区域3个功能区域组成。【结论】成功获得了肠炎沙门菌C50041ΔslyD缺失株和具有PPIase活性的重组SlyD蛋白。     

沙门菌鞭毛蛋白增强新城疫病毒融合蛋白在小鼠中的免疫原性

目的：分析沙门菌鞭毛蛋白对新城疫病毒（NDV）融合蛋白（F蛋白）免疫原性的增强作用。方法：提取鼠伤寒沙门菌SL7207株鞭毛蛋白,将鞭毛蛋白与F蛋白以皮下注射的方式联合免疫C3H/HeJ小鼠,间隔2周免疫,共免疫3次。分别在第2次免疫后2周和第3次免疫后2周采集血清,应用ELISA法测定小鼠血清抗体;在第3次免疫后2周取免疫小鼠脾脏细胞,检测IFN-γ和IL-4特异性分泌细胞。结果：鞭毛蛋白与F蛋白联合免疫能诱导产生特异性的免疫应答,血清抗体水平显著高于F蛋白单独免疫组;在脾脏细胞中,检测到较高水平的IFN-γ和IL-4分泌细胞,免疫应答以Th1型为主。结论：鞭毛蛋白与F蛋白的联合免疫,可显著增强F蛋白的免疫原性,显示出鞭毛蛋白良好的免疫佐剂效应。     

减毒鼠伤寒沙门氏菌介导的H5亚型禽流感病毒DNA疫苗的实验免疫效果研究

将运送H5亚型禽流感病毒DNA疫苗重组减毒鼠伤寒沙门氏菌以1.0×1010CFU剂量口服接种1日龄SPF雏鸡,结果表明重组菌对雏鸡具有良好的安全性。将重组菌SL7207(pVAX1-HA)和X4550(asd-pVAX1-HA)以2×109CFU的剂量两次口服免疫1日龄商品代伊莎褐蛋鸡,同时,将重组菌分别与pVAX1-IFN-γ或pVAX1-IL2(200μg/只)联合免疫,通过测定小肠粘膜抗体效价,结果显示,重组菌单独免疫组和联合免疫组能激发机体产生粘膜免疫应答,且与空载体组、空白对照组以及油苗组之间存在显著性差异(P<0.05)。攻毒后,免疫保护结果显示无论是重组菌单独免疫组还是联合免疫组均与空载体组和空白对照组之间存在显著性差异(P<0.05),而重组菌单独免疫组与联合免疫组之间不存在显著性差异,说明重组菌SL7207(pVAX1-HA)和X4550(asd-pVAX1-HA)能够提供机体抵抗HPAIV H5亚型强毒攻击的良好的免疫保护作用,这为进一步筛选出基于粘膜免疫途径的新型禽流感基因工程疫苗奠定了基础。     

空肠弯曲菌FlaA单克隆抗体的制备与鉴定

【目的】原核表达空肠弯曲菌鞭毛蛋白FlaA,并制备其单克隆抗体。【方法】克隆目的基因并将其构建到pET30a(+)和pGEX-6p-1表达载体,分别以变复性纯化后的rHis-FlaA、rGST-FlaA蛋白为免疫原和检测原进行杂交瘤细胞的筛选。采用间接ELISA法测定细胞上清和单抗腹水效价,Dot-ELISA、Western blot分析单抗特异性。【结果】成功构建pET30a(+)-flaA和pGEX-6p-1-flaA重组原核表达质粒,并融合表达rHis-FlaA和rGST-FlaA蛋白,Western blot试验显示天然蛋白多抗血清能与体外表达的蛋白呈现特异性反应,表明表达蛋白具有免疫原性。筛选获得3株稳定分泌抗FlaA的单克隆杂交瘤细胞株,分别命名为2D12、5E12、6A9,其Ig亚类分别为IgG2a、IgG1、IgG1,腹水效价分别为1∶102400,1∶102400和1∶51200;Western blot试验显示,3株单抗均能与表达rHis-FlaA重组蛋白的细菌发生特异性反应;Dot-ELISA试验表明,3株单抗均能与不同来源的空肠弯曲菌分离株发生特异性反应。【结论】本研究制备的单克隆抗体有较高特异性,具有良好的应用价值。为进一步研究空肠弯曲菌鞭毛蛋白的生物学特性、致病机理,以及建立快速检测技术奠定基础。     

小鼠巨噬细胞系体外感染BCG的应答

摘要：【目的】探讨小鼠巨噬细胞系RAW264.7体外感染BCG的应答。【方法】体外感染RAW264.7细胞23 h后,分析细胞形态和细胞表面共刺激分子的表达。然后去除培养上清中的BCG,继续培养不同时间,通过CFSE、annexin V/PI和Rh123标记,分析宿主细胞的应答。【结果】BCG感染23h后,细胞生长状态良好,细胞内能明显观察到吞噬泡中的BCG。细胞表面共刺激分子CD40、CD54、CD80、CD86、CD11b的表达明显升高,CD11c、I-Ad以及H-2Kd的表达变化不明显。CFSE标记BCG后,随着培养时间的延长,荧光强度逐渐减弱,但是4天后仍然明显地高于对照组。除去培养上清中的BCG后继续培养,含有BCG的细胞逐渐减少,继续培养60 h后基本检测不到。另外,BCG感染不能诱导细胞凋亡,线粒体膜电位先升高后降低,5天后,基本上与对照组一致。【结论】通过以上分析,为BCG免疫机理的研究提供了重要数据。     

小鼠巨噬细胞系体外感染卡介苗的应答

【目的】探讨小鼠巨噬细胞系RAW264.7体外感染卡介苗的应答。【方法】体外感染RAW264.7细胞23h后,分析细胞形态和细胞表面共刺激分子的表达。然后去除培养上清中的卡介苗,继续培养不同时间,通过CFSE、annexin V/PI和Rh123标记,分析宿主细胞的应答。【结果】卡介苗感染23h后,细胞生长状态良好,细胞内能明显观察到吞噬泡中的BCG。细胞表面共刺激分子CD40、CD54、CD80、CD86、CD11b的表达明显升高,CD11c、I-Ad以及H-2Kd的表达变化不明显。CFSE标记卡介苗后,随着培养时间的延长,荧光强度逐渐减弱,但是4天后仍然明显地高于对照组。除去培养上清中的卡介苗后继续培养,含有卡介苗的细胞逐渐减少,继续培养60h后基本检测不到。另外,卡介苗感染不能诱导细胞凋亡,线粒体膜电位先升高后降低,5d后,基本上与对照组一致。【结论】通过以上分析,为卡介苗免疫机理的研究提供了重要数据。