一种抗菌肽和aFGF融合蛋白的构建和表达

利用PCR技术扩增出带有凝血酶Xa因子切割位点的天蚕素蜂毒素杂合肽和aFGF的融合基因,插入大肠杆菌表达载体pET-3c中,构建出表达质粒pET-aF-CM,并转化至大肠杆菌BL21（DE3）中,氨苄青霉素抗性筛选重组转化子。IPTG诱导4h后,以包涵体形式表达的融合蛋白约占菌体总蛋白的17%。将包涵体溶解后透析复性,并利用肝素亲和层析纯化,得到电泳纯的融合蛋白。Western blot分析表明,该蛋白能与aFGF抗体产生免疫反应。MTT法检测显示,融合蛋白具有促3T3Bal/b细胞分裂活性,其比活为1.471×106IU/mg。利用凝血酶Xa因子裂解融合蛋白,可以获得抗菌肽和含凝血酶Xa因子裂解序列的aFGF蛋白。分子筛回收含杂合抗菌肽,抑菌活性检测表明其对大肠杆菌K12D31具有明显抑菌活性。微量稀释法检测结果表明,回收的抗菌肽对大肠杆菌DH5α、大肠杆菌K12D31、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和绿脓杆菌的MIC分别达6.25μg/ml、10μg/ml、2.5μg/ml、1.25μg/ml、0.625μg/ml和5μg/ml。     

不同储藏时间笔架茶生物碱成分分析

本实验以三种储藏时间不同的笔架茶1#、2#和3#茶为原料,用热回流法和有机溶剂萃取法联用的方法提取其生物碱,分析了热回流时间(A)和料液比(B)对三种茶生物碱提取率的影响。用M arqu is等五种试剂对提取的生物碱进行鉴定分析,并用HPLC分析生物碱主要成分的含量。结果表明:笔架茶中生物碱的含量随储藏时间的延长而降低。A和B对储藏时间不同的三种笔架茶生物碱提取率的影响各不相同。沉淀及显色反应鉴定显示提取生物碱的主要成分为咖啡因,HPLC定量分析表明3#新茶生物碱中咖啡因含量最高(94.33%),1#陈茶咖啡因含量最低(75.76%)。     

丝胶预处理对糖尿病大鼠睾丸IGF-1表达的影响

目的探讨丝胶预处理对2型糖尿病大鼠睾丸胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)表达的影响。方法 30只雄性SD大鼠随机分为3组(n=10):正常对照组、糖尿病模型组和丝胶预处理组。链脲佐菌素连续腹腔注射制作2型糖尿病大鼠模型,以血糖≥16.7mmol/L作为成模标准;丝胶预处理组大鼠在注射链脲佐菌素前给予丝胶灌胃(2.4g/kg/d)35d。采用葡萄糖氧化酶法检测血糖,采用ELISA方法检测大鼠血清睾酮和IGF-1水平;分别采用免疫组化染色和RT-PCR法检测睾丸IGF-1蛋白和mRNA的表达。结果丝胶预处理可明显抑制糖尿病大鼠血糖升高,血清睾酮、IGF-1水平的降低,睾丸IGF-1表达的下降(丝胶预处理组与糖尿病模型组比较:P0.01)。结果 丝胶预处理可通过阻止糖尿病大鼠睾丸IGF-1表达的下调,改善生精功能,发挥对糖尿病生殖功能损害的预防保护作用。     

具抗菌活性放线菌菌株JSM 20.1的分离和鉴定

从药用植物银杏(Ginkgo biloba)根际土壤中分离到1株放线菌菌株JSM20.1,其发酵产物具有广谱抗菌活性。该菌株在多数培养基上生长良好,具有链霉菌属的典型形态特征。菌丝多分枝,不断裂;基内菌丝黄白色至棕褐色,气生菌丝黄白色至棕红色;孢子链直且长,偶有波曲,孢子柱状、光滑、不运动。在察氏、马铃薯浸汁、葡萄糖-天门冬酰胺、酵母膏-麦芽膏(ISP2)、燕麦(ISP3)、无机盐淀粉(ISP4)和甘油-天门冬酰胺(ISP5)琼脂上均产生可溶性色素,而在营养琼脂上不产生可溶性色素。生长温度范围为7～40℃,最适生长温度28℃;生长pH范围为5.0～10.0,最适pH7.0;能在含0～3%(质量与体积比)NaCl的培养基上生长,而在无NaCl的ISP2培养基生长最佳。根据其形态学特征、生理生化特征、细胞化学分类特征和基于16SrRNA基因序列的系统发育分析结果,菌株JSM20.1被鉴定为链霉菌属的有效发表种Streptomyces cyaneofuscatus的1个菌株。     

五指山小型猪单个核细胞表面α Gal抗原表达差异的分析

利用猪的器官为挽救脏器终末衰竭病人而进行的异种移植是有效救治病人的途径之一.由于猪细胞表面存在的α1,3半乳糖会引起超急性免疫排斥反应,导致移植器官最终被移植受体排斥.除人类和旧大陆猴外,所有哺乳动物细胞表面都有αGal半乳糖表达,但个体间表达量存在显著差异.为研究近交系五指山小型猪细胞表面α1,3半乳糖表达的个体差异,本实验利用FITC-isolectin进行荧光标记,通过流式细胞术以及激光共聚焦分析,对14例5月龄猪样本外周血单个核细胞表面的α1,3半乳糖水平进行检测.利用猪肾上皮PK15细胞确定FITC-isolectin标记的最适浓度为25ng/μl(细胞标记效率大于85%).结果显示,14头猪外周血单个核细胞表面α1,3半乳糖的表达差异范围在1.25～2.09倍之间,远低于普通非近交系猪的个体差异.本研究为利用近交系五指山小型猪作为异种器官移植的研究材料提供了基础数据.     

根癌农杆菌介导的Pr1基因在贵阳腐霉的组成性表达

【目的】构建组成性表达贵阳腐霉Pr1基因的载体pCambia-hph-Pr1,转化贵阳腐霉,以获得高毒力的基因工程转化菌株。【方法】以双元载体pCambia-Pnos-PNN-hph为基本骨架,将Pr1基因置于组成型启动子PgpdA和终止子TtrpC之间,获得含Pr1基因的表达元件。以贵阳腐霉菌丝体为受体材料,利用根癌农杆菌介导的遗传转化法转化贵阳腐霉,观察转化株的生物学特征和灭蚊毒力。【结果】转化株的菌丝生长速度和游动孢子产量与野生株无显著性差异。生物测定表明转化株对蚊幼虫平均致死率达到32.9%,比野生株提高了约一倍,并且使受试蚊幼虫生长速度明显减缓。【结论】利用根癌农杆菌介导的遗传转化获得了遗传稳定的高毒力菌株。     

基于健康保障责任的县级医院综合改革思路探讨

从健康保障出发,县域的医疗保障需要由县医疗服务体系承担,其中,县医疗服务体系主要由公立医院组成。县政府是透过县医疗服务体系管理公立医院,由此确定相应的投入责任和管理体制。在医疗服务体系的管理下,外加医疗保险及新农合对医院医疗费用的管理,县级医院依据外部环境和条件构造内部管理体制。当前县级医院管理体制改革中存在两个关键问题：一个是农村基层医疗卫生机构（乡镇卫生院和村卫生室）对医疗服务体系和卫生服务体系的连体问;另一个是在经济上调整医患双方利益问题,解决这两个问题将有利于推进县公立医院综合改革。     

城乡居民对药品零差价政策意愿及就医行为调查分析

加快推进以药品零差价销售政策为核心的基本药物制度,已成为促进新医改提出的建立健全覆盖城乡居民基本医疗卫生制度目标的重要环节,城乡居民对零差价政策的支持意愿及就医行为变化无疑是政策实施效果的重要观察点。以浙江省中部某县级市城乡居民对药品零差价政策意愿与就医行为及影响因素分析数据为基础,分析了政策成效及存在问题。结果表明, 城乡居民对药品零差价政策的了解意愿和知晓程度偏低,年龄、平均月收入、政策知晓度、次均医疗费用下降度、药品种类满足需求度、限制销售非零差价药品的支持度等是影响居民经常性流向城乡社区医疗服务机构及首诊选择愿意的主要促进因素。并针对问题与发现,提出了相关思考与讨论建议。     

α-硫辛酸对H9c2细胞在H2O2导致的氧化应激损伤中的保护作用

缺血再灌注产生的氧自由基会导致心肌细胞凋亡. 近年研究发现, α-硫辛酸（α-lipoic acid, LA）具有抗氧化作用, 但LA是否能够对抗心肌细胞凋亡, 保护心脏功能的作用尚未明确. 本研究利用H2O2诱导的心肌细胞H9c2氧化应激模型, 分别用CCK 8方法检测细胞存活率、Hoechst33342染色观察细胞核的形态变化、流式细胞术检测细胞凋亡率、real time PCR法检测Bcl 2/Bax基因表达变化, 评价LA是否具有对抗氧化损伤引起的心肌细胞凋亡能力. 结果显示, LA能提高H2O2损伤的H9c2细胞存活率, 降低心肌细胞凋亡, 而且LA通过上调Bcl 2的表达而发挥抑制细胞凋亡的作用. 研究结果证实, LA对氧化应激损伤的心肌细胞具有较好的保护作用. 该研究为LA在临床上用于治疗氧化应激引起的心肌细胞凋亡提供了实验依据.     

牦牛乳酸脱氢酶B基因突变体的克隆鉴定研究

通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分析证实牦牛（Bos grunniens）乳酸脱氢酶存在两种类型,根据LDH同工酶谱的特点推测牦牛LDH多态是由B基因变异所致,并由此将凝胶电泳中迁移率快的LDH同工酶谱带称为LDH－Bf类型,迁移率慢的称为LDH－Bs类型．为阐明牦牛LDH变异体的分子机制,实验从牦牛心脏组织中提取总RNA,采用RT-PCR方法分别克隆了LDH－Bf和LDH-Bs两种类型的B基因cDNA全长序列;序列比对分析发现LDH-Bf和LDH-Bs基因存在4个碱基差异;依据cDNA序列推导的氨基酸序列的比对分析,发现两者之间存在两个氨基酸差异;利用Deepview分子建模软件进行的牦牛H亚基及LDH1突变体的高级结构预测,发现突变的两个氨基酸都能产生新的H键,影响整个蛋白分子的H键网络,并进一步导致蛋白分子空间结构的变化．