绿色荧光蛋白基因原核表达载体的构建及其在昆虫肠道短短芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌中的表达

【目的】构建带有苏云金芽孢杆菌cry3a基因非芽孢依赖启动子和绿色荧光蛋白基因gfp(Green Fluorescent Protein)的原核表达载体,并转化从桑粒肩天牛幼虫肠道分离的两株常驻细菌短短芽孢杆菌CQUBb和苏云金芽孢杆菌CQUBt,以检测cry3a启动子在昆虫肠道常驻菌中的启动子活性,获得GFP标记菌株,为常驻菌在昆虫幼虫肠道中的定殖情况和杀虫工程菌的构建奠定基础。【方法】采用重叠延伸PCR将cry3a基因启动子和gfp基因进行融合,并与pHT304载体连接构建重组质粒pHT3AG,获得的重组质粒以电脉冲转化肠道常驻菌短短芽孢杆菌CQUBb和苏云金芽孢杆菌CQUBt,于可见光和荧光显微镜下观察荧光并通过SDS-PAGE分析重组菌株的蛋白表达情况,然后对重组菌株进行生长动力学分析和稳定性测试。【结果】重组菌在营养期大量组成型表达GFP,经电泳分离在凝胶上出现约29kDa的特异蛋白条带;重组菌生长曲线与出发菌没有显著差异,说明外源质粒未对宿主菌的生长带来明显不利影响;抗性条件下传代30次后两菌株外源质粒稳定性仍可达95%、67%;两个菌株比较,CQUBb比CQUBt质粒转化率高、重组菌GFP表达时间长、表达量大,并且重组菌株稳定性好。【结论】成功地将cry3a基因核心启动子和gfp基因转入桑粒肩天牛幼虫肠道常驻菌,实现了该启动子在Bt之外的菌株中发挥作用,构建了两个GFP标记菌株;重组基因工程菌株表达量大,稳定性好,可以用作昆虫肠道内微生态研究和芽孢杆菌表达系统以及杀虫菌株的构建。     

白叶枯病菌胁迫下云南普通野生稻SSH文库的构建及抗病相关基因分析

以云南普通野生稻为材料,利用抑制差减杂交技术（SSH）,构建了白叶枯病菌胁迫的云南普通野生稻特异表达基因的差减文库.通过对文库所有阳性单克隆进行测序,聚类分析后共获得494条高质量的表达序列标签（EST）.经过BlastN分析,有417条与已知功能的序列有较高同源性;经BlastX分析,有104条EST与未知功能蛋白或假定蛋白有较高相似性,49条EST未能找到同源匹配,341条EST与已知功能蛋白有较高同源性.初步分析发现,这些基因主要涉及能量代谢、蛋白质代谢、核酸代谢、防御与抗逆应答反应、信号转导、光合作用及膜运输等代谢过程.使用半定量RT-PCR研究了7个可能与白叶枯病抗性相关的EST序列在云南普通野生稻对照和白叶枯病菌处理的叶片中的表达情况,并获得这些基因的表达谱.结果发现,克隆编号为OR7,OR68和OR826的EST受白叶枯病菌胁迫诱导上调表达,其中OR826 EST在蛋白数据库中无同源序列,可能是一类新的白叶枯病抗性基因,而组成型表达的OR143 EST在对照和接菌处理的叶片中均能检测到其mRNA的表达,但其表达量在白叶枯病菌胁迫48 h后逐渐增强,推测这些基因直接参与了云南普通野生稻抗病防御反应.本研究为从云南普通野生稻中发掘和克隆新的白叶枯病抗性基因提供了理论依据,为进一步研究云南普通野生稻抗白叶枯病的分子机制奠定了基础.     

基于16S rDNA序列的柑桔木虱体内共生菌多样性研究

昆虫消化道内是一个复杂的微生态系统,有大量的微生物存在.这些微生物对寄主发育、营养吸收和防御方面都起着重要的作用.本文利用基于16S rRNA基因的PCR-RFLP指纹图谱法和变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)的方法对柑桔黄龙病虫-媒柑桔木虱Di...     

酶解破壁促进废次烟叶中茄尼醇溶浸

协同应用纤维素酶和木质素酶催化降解废次烟叶,探讨清洁高效的酶解破壁效应及浸提茄尼醇工艺条件。结果发现复配酶催化裂解溶浸茄尼醇效果明显优于单一酶,酶解时间、温度、pH值以及酶投加量等条件均影响酶破壁浸提茄尼醇能效。结果表明,采用纤维素酶：木质素酶酶活比15∶1 (U/U) 的复配酶,在体积为5倍烟草质量的水介质环境中,当复配酶投加量为175 U/g,水浴温度40 ℃,pH=6时,催化酶解烟叶8 h后,茄尼醇溶浸浓度可达0.33 g/L。在此条件下,茄尼醇平均提取率可达96.53％,是化学回流浸提方法的1.68倍。该方法为有效提取废次烟草中茄尼醇提供了一种新途径。     

大质粒DNA疫苗pSVK-CAVA高稳定性宿主菌的筛选与鉴定

目的:从多种大肠杆菌感受态细胞中筛选出适合该研究大分子质粒DNA疫苗的宿主菌,鉴定其达到中试要求。方法:将疫苗质粒pSVK-CAVA(14.7kb)转化4种大肠杆菌化学感受态细胞并提取质粒,通过琼脂糖凝胶电泳实验检测质粒的形态结构。对基因工程菌进行生化检测,并通过连续传代法和酶切鉴定进行稳定性检测,同时将质粒DNA瞬时转染至293T细胞中检测质粒表达能力。选取质粒含量最高和稳定性最好的宿主菌作为原始种子分装冻存,将原始种子库扩大培养,逐级建立好主种子库和工作种子库即三级种子库。通过摇瓶培养实验在4种常用基础培养基中挑选出最适合质粒生产的培养基。结果:确定了XL-10 Gold作为质粒DNA疫苗pSVK-CAVA的宿主菌,基因工程菌传代稳定性和结构稳定性良好,质粒能在293T细胞中体外表达。筛选出TB培养基为基础培养基,质粒容积产量达到9.9mg/L,比LB培养基提高了接近1倍。结论:该研究筛选出大肠杆菌XL-10 Gold作为质粒DNA疫苗的宿主菌,解决了大质粒在常用宿主菌中不稳定的难题,并对基础培养基进行了初步优化。     

传统补酒中邻苯二甲酸酯类化合物测定方法的优化及产生原因的分析

建立了传统补酒中十八种邻苯二甲酸酯类化合物的气相色谱-质谱测定法,所建方法各目标化合物在各自浓度范围内线性良好,相关系数均大于0.9990,方法定量限0.025 mg/kg或者0.125 mg/kg,比国标方法规定的定量限0.3 mg/kg~9.0 mg/kg降低了许多。仪器精密度0.8%~3.4%,对于黄酒基传统补酒的加标回收率93.8%~108.8%,相对标准偏差0.2%~5.6%,对于白酒基传统补酒,加标回收率84.3%~111.3%,相对标准偏差0.3%~8.6%。本方法对于传统补酒企业的内部质量控制起到了重要的作用。同时,对该企业全品类传统补酒成品及关键原料进行了分析,找到了传统补酒中邻苯二甲酸二正丁酯(DBP)偏高的原因,是生产设备内衬高分子材料引起的,建议全部改用食品级不锈钢设备。     

武汉自然博物馆——倚大河展示世界,以生命召唤和谐

正武汉自然博物馆是一座特色十分鲜明的自然类博物馆,以肯尼斯·贝林大河生命馆为主体,以长江文明馆和武汉园博园为两翼,收藏展示了长江流域自然文化精华、中国灿烂的园林艺术精品以及世界主要大河流域的生物多样性。武汉自然博物馆、肯尼斯·贝林大河生命馆"大河之旅生命之歌"的展览主题鲜明,大河     

中药止痛贴与吗啡联合应用于癌症疼痛的镇痛效果及安全性

目的:探讨中药止痛贴与吗啡联合应用于癌症疼痛治疗中的镇痛效果及安全性。方法:选取2016年5月至2017年5月我院收治的100例中重度癌症疼痛患者为研究对象,根据随机数字表方法将入选的患者分为对照组和研究组,每组50例。对照组患者给予吗啡治疗,研究组患者在此基础上联合应用中药止痛贴治疗,连续给药14天。比较两组患者的临床疗效、数字评分法(digital scoring method,NRS)、爆发痛次数、吗啡使用量、中医证候评分。结果:研究组患者治疗总有效率为96.0%,显著高于对照组患者(86.0%,P0.05)。研究组盐酸吗啡缓释片使用剂量[(83.23±23.14)mg/d]低于对照组[(110.13±25.23)mg/d](P0.05)。治疗前,两组患者各中医证候评分比较差异均无统计学意义(P0.05);治疗后,两组患者各中医证候评分均较治疗前明显降低,且研究组显著低于对照组,差异有统计学意义(P0.05)。研究组患者的NRS评分、爆发痛次数显著低于对照组(P0.05),两组患者均未见严重的不良反应。结论:中药止痛贴与吗啡联合应用于癌症疼痛的可有效提高镇痛效果,改善患者的中医证候,减少吗啡使用量,且安全性高。